碱性磷酸酶基因表达载体构建及在大肠杆菌中表达.docVIP

碱性磷酸酶基因表达载体构建及在大肠杆菌中表达 　　【摘 要】碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达就是从大肠杆菌的pET-44a-BAP质粒中亚克隆编码碱性磷酸酶的基因BAP，通过设计BAP的特异性引物获得大量BAP基因片段，构建pMD19-T-BAP克隆载体，进行酶切，再构建pET-his-BAP表达载体，转化BL21，成功表达出BAP基因的蛋白产物。 　　【关键词】碱性磷酸酶；基因表达；载体；大肠杆菌 　　引 言 　　碱性磷酸酶（Alkaline phosphamse）是一个非特异性磷酸单酯酶，能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相对应的醇、酚或糖。碱性磷酸酶既是生物体内一种重要的调控酶；也是基因工程、临床诊断的一种重要工具酶，已广泛应用于疾病检测、食品检验、医药生产等领域。本实验通过亚克隆、连接、酶切等不同的技术手段，构建碱性磷酸酶基因表达载体，在大肠杆菌中得以表达。 　　1、材料 　　1.1 实验仪器。电热恒温水浴锅，电子分析天平，磁力搅拌器，高速冷冻离心机，分光光度计，4度冰箱，摇床，微量移液器，涡旋振荡器，电泳仪，PCR仪，超净工作台，灭菌锅。 　　1.2 试剂及溶液。Tris，考马斯亮蓝，氢氧化钠，氯化钠，95%乙醇，盐酸，SDS， 琼脂，酵母提取物，乙酸（TAE）缓冲液，LB培养基，转化试剂。 　　1.3 菌种和质粒。DH5a菌，BL21（DE3）菌，PET-his 菌。PET-his， pET-44a-BAP。 　　2、方法 　　2.1 引物的设计。根据pET-44a-BAP上插入的BAP序列，用primer primer 5.0 软件设计引物。引物序列如下：上游引物 5′cggacaccagaaatgcct 3′；下游引物5′gccgctctggggctgaaa 3′ 　　2.2 碱性磷酸酶基因的PCR扩增。在0.2mLPCR微量离心管中按下列剂量配制50μL反应体系：其中Premix Taq酶：45μL、模板质粒pET-44a-BAP：1μL、引物1：1μL、引物2：1μL、Ddwater：2μL，总体积为50μL。PCR结束后，取9μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。 　　2.3 DH5a和BL21（DE3）感受态的制备。将菌液分装到1.5mL预冷的无菌离心管中，冰上放置10min，然后于4℃，5000r/min离心10min。弃上清后，加入1mL的0.1mol/LCaCl2 溶液，混匀，插入冰中放置30min。4℃，5000r/min离心10min。弃上清后，用1mL的0.1mol/LCaCl2 溶液垂悬，插入冰中放置30min。4℃，5000r/min离心10min。弃上清液后，用200μL 0.1mol/LCaCl2 溶液垂悬，超净工作台中按每管100μL分装到1.5mL的无菌微量离心管中，4℃保存。 　　2.4 PMD19-T-BAP的构建及转化和检测 　　2.4.1 PCR产物与T载体直接连接 　　2.4.2 DH5a的转化 　　2.4.3转化克隆的筛选和鉴定 　　2.5 pET-his及BAP的酶切和回收 　　0.5mL离心管中混合下列溶液：Pet-his /PMD19-T-BAP质粒：34μL、Quick HindIII：1μL、Quick BamHI：1μL、10× Quick buffer：4μL，总体积为40μL。混匀，瞬时离心。37℃水浴中酶切30min。取9μL酶切产物，与已知分子量的DNA对比电泳，以确认酶切是否成功。 　　回收酶切后的目的片段：柱平衡。向胶块加700μLPN，50℃水浴10min。加到吸附柱CA2中，置2min，12000rpm离心1min，倒废液。加600μL漂洗液PW，离心1min，倒废液。重复上述步骤。空转2min，放3min晾干。将吸附柱放到干净的离心管中，加50μL洗脱缓冲液EB，置2min，离心2min，收集DNA溶液。4℃保存。 　　2.6 pET-his-BAP的构建及转化和检测 　　2.6.1 BAP与pET-his大片段连接 　　2.6.2 BL21（DE3）的转化 　　2.6.3转化克隆的筛选和鉴定 　　2.7 pET-his-BAP的诱导表达 　　OD值为0.5时可进行诱导表达。除BL21（DE3）空菌不加IPTG以外，其余的每管都加3μLIPTG，37℃摇菌。含有pET-his-BAP重组载体的菌液1.5-3h梯度摇菌。1.5h，2h，2.5h，3h时各取1.5mLpET-his-BAP重组载体的菌液2500r/min离心15min，倒上清，加入20μL的ddwater震荡混匀后加入20μl的上样缓冲液，封口煮沸5min，立即插入冰中。 　　2.8 碱性磷酸酶表达的SDS检测 　　进行SDS电泳，用考马斯亮蓝染色。清