小鼠IL-0基因的克隆.pptVIP

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2018-07-05 发布于浙江
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小鼠IL-0基因的克隆.ppt

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小鼠IL-0基因的克隆

小鼠IL-10基因的克隆及其原核表达林臻桢 07生技2班 2007060319 IL-10简介姓名：白细胞介素 10 （IL-10）曾用名：细胞因子合成抑制因子（ CSIF） , 出身地：主要由Th2细胞产生, Tho细胞,Th细胞,CD8+T 细胞,活化的B细胞,单核-巨噬细胞,kupffer细胞,肝细胞,角化细胞等技术路线 * * 缺点：短暂的自限性分泌, 在一般水平 IL-10 的分泌量都很低只有在特殊的诱导和刺激下才可能出现高水平的表达。光荣事迹：细胞因子在免疫调节和炎症反应上有多重性。它可下调节的Th1细胞因子的反应， MHCⅡ类抗原表达，巨噬细胞共刺激分子。它也提高B细胞生存，增殖，抗体的生产。这可以阻止细胞因子NF -κB活性，并在 JAK - STAT信号通路的调节。　　根据 GenBank 中报道的小鼠（登录号NM-010548 ）IL210mRNA 序列设计特异性引物 P1 和 P2,预期扩增长度为537bp。 P1:5′GGATCCATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTT3′ P2:5′AAGCTTTTAGCTTTTCATTTTGATCATCATGTATGC3′ 于37 ℃下用MEM培养液（ 8%的犊牛血清， 10mg/L 刀豆素 ConA 以及 1% 双抗(终浓度为100 μ g/mL 青霉素、链霉素 )进行培养。根据总 RNA 提取试剂盒说明总 RNA 的提取脾细胞的制备 IL210 基因的 RT-PCR 扩增 PCR 产物凝胶回收克隆及序列测定原核表达载体 pET2IL210 的构建 IL210 在大肠杆菌中的表达及其检测引物的设计与合成酶切位点：BamH Ⅰ HindⅢ 大肠杆菌JM109感受态细胞含Amp 100 g/mL 的LB 培养基 37 ℃振荡培养 16h pMD18-T 提取质粒用限制性内切酶（BamHⅠ、Hind Ⅲ）酶切和 PCR 方法鉴定获得重组质粒命名为pT-IL-10 质粒 pT-IL-10 BL21宿主菌双酶切、回收片段、连接转化质粒 pT-IL-10 原核表达载体 pET28a pETIL-10 原核表达载体pET28a IPTG诱导剂量为 1μL/mL的pETIL-10 M IPTG诱导剂量为1.5μL/mL和2.0μL/mL的pETIL-10 M BL21菌未诱导转染重组pETIL-10诱导的BL21的免疫印记 southern印迹杂交