耐盐薄荷离体培养与植株再生研究.docVIP

耐盐薄荷离体培养与植株再生研究 　　摘 要：为研究耐盐薄荷的快速繁育技术，以耐盐的椒样薄荷茎段为外植体，采用正交试验L4（23）筛选其愈伤诱导培养基。研究结果表明，NAA是影响耐盐薄荷诱导愈伤能力的重要因素，其最适浓度为0.2 mg/L，愈伤诱导率达92%以上。在此基础上，通过扩大培养基中6-BA浓度进行不定芽增殖培养基筛选，最终确定增殖培养基为2/3 MS+5.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L琼脂，pH值6.0（灭菌前）；此培养基下培养，增殖系数达19.23。在诱导生根培养基的筛选中，综合分析植株生长量（株高）、生根数量（根数）及根生长量（根长），确定生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L琼脂，pH值6.0。 　　关键词：椒样薄荷；离体培养；诱导；增殖；植株再生 　　土壤盐渍化问题是困扰农业生产的一大难题。当前，世界上灌溉地面积约为230 Mhm2，其中遭盐害影响的土壤约占45 Mhm2。旱地农业面积约为 　　1 500 Mhm2，其中遭盐害影响的土壤约占32 Mhm2。耕地土壤盐渍化的退化面积正在以3 hm2/min的速度增长。据FAO估计，世界范围内，每年因盐害丧失生产力的土地面积达0.25 M～0.50 Mhm2[1]。就我国而言，在1亿 hm2耕地中有667万 hm2盐碱化土壤，另有0.346亿 hm2盐碱荒地[2]。随着人口的剧增及工业的高速发展，我国可耕地面积急剧下降，同时，不合理灌溉又造成了大量良田的次生盐渍化。 　　因此，开发和利用大面积盐渍化土地，利用耐盐植物资源发展盐渍地生态农业十分必要。 　　耐盐薄荷是山东省科学院中日友好生物技术研究中心经耐盐性试验筛选出的，系椒样薄荷（Mentha piperita L.）的一种，耐受NaCl胁迫浓度为0.8%。耐盐薄荷除具有薄荷的一般功效外，还因具有耐盐碱性而作为药赏两用植物逐渐被关注。耐盐薄荷是水薄荷与绿薄荷杂交而成的一个不育性中间类型，以分株繁殖为主。但长期采用无性繁殖，易发生病害，引起品种退化和产量、质量下降[3，4]。研究证明，成熟完善的植物组织培养技术是解决品种退化和更新的有效手段之一[5，6]。因此，本研究以耐盐的椒样薄荷茎段为外植体，对其离体培养及植株再生条件进行了研究，以期为耐盐薄荷的品种改良和快速繁殖提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试薄荷外植体取自山东省科学院生物中心中澳盐生植物实验基地。 　　1.2 试验方法 　　①外植体灭菌 从苗圃中取生长旺盛的薄荷植株，去叶留茎和芽点，流水冲洗20 min后，用滤纸吸干水分，在超净工作台上用75%酒精消毒 　　1 min、0.1% HgCl2溶液消毒8～10 min 后，用无菌水冲洗4～5遍，吸干水后用手术剪对外植体进行修剪，截取长度2～3 cm的茎段，并将其接种在1/2 MS培养基中，置于光照培养箱中培养。3 d后挑取无污染茎段转接至愈伤诱导培养基中。 　　②愈伤诱导培养基的筛选 采用正交试验 　　L4（23）筛选。选取上述培养的无菌苗，置于培养基中，进行愈伤的诱导。培养30 d 后，调查愈伤诱导率。愈伤诱导率（%）=茎段愈伤形成个数/接种的茎段个数×100%。 　　③不定芽增殖培养基的筛选 取3 cm长的健壮无菌苗，接种到不同浓度6-BA和NAA配比的2/3 MS 培养基中，并添加30 g/L蔗糖和4 g/L琼脂进行不定芽诱导。培养50 d（期间转接1次）后，调查增殖系数。不定芽增殖系数（%）=不定芽总数/接种的茎段数×100%。 　　④生根培养基的筛选 取3 cm 长的健壮无根苗， 接种到不同浓度6-BA 和NAA 配比的1/2 MS 培养基中，并添加30 g/L蔗糖和4 g/L 琼脂进行生根诱导。培养2周后，统计植株生长量（株高）、生根数量（根数）及根生长量（根长），3周后进行比较分析。 　　⑤培养条件 以上每个处理各接种5 瓶，每瓶5株，重复5次。培养基pH 值均为6.0（灭菌前），光照培养箱温度（24±2）℃，生根光照时间12 h/d （日光灯光照强度2 000 lx），其他光照时间14 h/d。 　　对所得数据用SPSS 10.0软件包计算方差，对处理间进行0.05 水平上的差异显著性分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 愈伤诱导培养基的筛选 　　由表2可知，正交优选配方为A（1，2）B1C2，即1/2 MS（2/3 MS）+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L琼脂。由R值可知，NAA（C）是重要因素，6-BA（B）是较重要因素，MS（A）是影响较小因素，即影响因素CBA。因此，通过该试验确定NAA是耐盐薄荷诱导愈伤能力的重要因