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芍药苷人工抗原合成与鉴定 　　[摘要] 利用高碘酸钠法合成芍药苷免疫抗原PF-BSA和包被抗原PF-OVA，并通过紫外光谱检测芍药苷成功与BSA/OVA偶联。小鼠经PF-BSA免疫后，体内可产生抗芍药苷抗体，酶联免疫分析法分析证明其免疫小鼠所得抗体效价达1∶12 800，半数抑制浓度为0.791 mg?L-1，且与黄芩苷等9种中药小分子交叉反应极低。芍药苷人工抗原的合成及抗体的获得为建立ELISA和研制免疫检测试剂盒奠定了基础。 　　[关键词] 芍药苷；人工抗原；高碘酸钠氧化法；免疫分析方法；抗芍药苷抗体 　　[收稿日期] 2013-12-03 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目81274043） 　　[通信作者] 赵琰，研究方向为中药免疫分析技术，Tel：（010 E-mail：zhaoyandr@ 　　[作者简介] 屈会化，副研究员，硕士生导师，研究方向为中药免疫分析技术，E-mail： quhuihua@ 　　芍药苷（paeoniflorin，PF）为常用中药芍药的主要有效成分和指标性成分，是一种单萜类糖苷化合物。[1]。研究表明，芍药苷具有多种生物学活性，对心血管、中枢神经系统、免疫系统以及平滑肌等方面均有肯定的药理作用[2]。近年来，有关学者还对芍药苷保护心肌细胞、缺血诱发的脑损伤以及降低谷氨酸诱导的细胞神经毒性等作用有了进一步研究[3-5]。 　　目前，对PF的检测主要采用高效液相色谱法（HPLC），该法已被广泛应用于芍药药材、含有芍药的中成药和复方制剂等的检测[6-8]。然而，PF进入体内后，在血浆、组织中的含量较低，检测较为困难，对PF检测方法的样品前处理简单化提出了更高的要求。与HPLC相比，酶联免疫分析法（ELISA）无需复杂的样品前处理过程，能够检测到血浆样品中纳克甚至皮克水平的PF，为研究治疗剂量（0.5～40 mg?kg-1）条件下的PF体内代谢过程提供了可行的检测方法。 　　要建立芍药苷ELISA方法首先需制备出特异性的抗体。由于PF是小分子抗原，本身不具备诱导产生抗体的能力，为此需将PF小分子作为半抗原与大分子的载体蛋白偶联制备出全抗原。本实验采用改进的高碘酸钠法制备了芍药苷人工抗原PF-BSA和包被抗原PF-OVA，为芍药苷ELISA的建立及检测试剂盒的研制奠定了基础。 　　1 材料 　　1.1 动物 SPF级雌性BALB/c小鼠3只，6～8周龄，维通利华实验动物中心提供，动物许可证SCXK-（京） 2012-0001。 　　1.2 试剂 芍药苷（PF，HPLC检测含量达90%，南京泽朗医药科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；鸡卵清白蛋白（OVA，Sigma公司）；弗氏完全佐剂（F5881，Sigma公司）；弗氏不完全佐剂（F5506，Sigma公司）；酶标二抗（HRP标记羊抗鼠IgG，GeneScript公司）；其他NaIO4，Na2CO3，Na2HPO4，NaH2PO4，NaCl，KCl等常用试剂为国产分析纯。中药活性成分对照品（黄芩苷、甘草苷、栀子苷）购自中国食品药品鉴定研究院，中药活性成分原料药（黄芩素、芦丁、葛根素、橙皮苷、甘草酸、柚皮苷）购自南京泽朗植提。 　　1.3 仪器 96孔酶标板（美国康宁）；紫外-可见分光光度计（Beckman coulter DU800）；酶标仪（Themo MK3型酶联检测仪）；84-1A磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。 　　2 方法 　　2.1 芍药苷人工抗原的合成 采用高碘酸钠法合成芍药苷人工抗原PF-BSA和PF-OVA。具体合成方法参照文献[9-10]，将PF的甲醇溶液（含PF 37.5 mg）逐滴加入3 mL 25%NaIO4溶液中，缓慢搅拌1 h后，用1 mol?L-1Na2CO3溶液调节pH，然后逐滴加入含35 mg BSA的CBS溶液（或含60 mg OVA的CBS溶液），再调pH至9.0以上，搅拌1 h之后，蒸馏水透析3 d，分装保存。 　　2.2 合成抗原紫外扫描鉴定 采用紫外分光光度法扫描合成抗原的紫外光谱，将PF，BSA，OVA，PF-BSA和PF-OVA分别稀释成一定的浓度，进行200～400 nm紫外光谱扫描。 　　2.3 合成抗原的免疫鉴定[11-12] 将2.1合成的PF-BSA作为免疫抗原，免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠按常规免疫程序加强免疫3次后断尾取血并采集抗血清。以PF-OVA为包被抗原，采用间接ELISA测定抗血清效价及其特异性和交叉反应性。 　　3 结果 　　3.1 免疫抗原PF-BSA的紫外扫描鉴定 紫外扫描光谱图见图1，PF在230 nm处有最大吸收峰，载体蛋白BSA在278 nm处有最大吸收峰。BSA与PF偶联后，PF-BSA的峰性