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蛋白质组学方法研究唐草片对微粒体CYP450酶影响 　　[摘要] 艾滋病（AIDS）患者常用唐草片进行辅助甚至替代治疗，然而中药成分复杂，其对抗病毒药物的影响及其作用机制尚不清楚。CYP450酶是药物的主要代谢酶，因此，研究中药唐草片与依非韦伦联合用药前后对CYP450酶的调控具有重要意义。蛋白质组学以其高通量高灵敏度的特点被广泛用于代谢酶的研究。 该文采用差速离心法分离肝微粒体，SDS分离其蛋白质，切取CYP450所在的3条电泳带，用液相色谱串联质谱进行鉴定，一共鉴定了16个CYP450同工酶。为了定量分析唐草片对CYP450酶的影响，采用基于质谱的多反应监测技术（MRM）。根据蛋白质的质谱鉴定结果，选择CYP2C11。其特征多肽通过Expasy blast搜索获得。片断离子的m/z　　[关键词] 唐草片；蛋白质组；CYP450；依非韦伦 　　[收稿日期] 2014-01-10 　　[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2012Z；国家自然科学基金面上项目 　　[通信作者] 张丽军，Tel： （021 E-mail： zhanglijun1221@163.com；程能能， E-mail： nncheng@ 　　细胞色素CYP450是一个多功能氧化酶的超家族，为临床70%～80%药物的第一相代谢酶[1]，在药物作用下CYP450酶也发生表达和功能调控等变化[2]。近年来研究发现很多中草药如人参和藜芦等都对CYP450酶有调控作用[3-4]。唐草片是唯一一个被国家食品药品监督管理局（CFDA）批准用于HIV感染者的辅助用药，正被越来越多的患者所使用。但是唐草片成分复杂，其对抗病毒药物的影响令人担忧。因此，研究唐草片和抗病毒药物（如依非韦伦）联合用药时对CYP450蛋白质表达的影响具有重要意义。 　　研究CYP450酶的方法常为免疫酶联、酶活测定以及PCR等，但是这些方法难以批量研究CYP450酶。近年发展的蛋白质组学方法以其高通量、高灵敏度等特点在CYP450酶研究中得以应用[5]。本研究采用SDS分离微粒体蛋白质、切取CYP450酶对应分子量的条带、通过液相色谱串联质谱进行鉴定，采用多反应监测（MRM）方法对鉴定的CYP2C11进行定量分析。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品与试剂 依非韦伦片剂（规格600 mg/片， 批号S2520） 由Merck公司生产，唐草片（规格400 mg/片，批号090301）由上海百岁行药业有限公司生产。蛋白质组试剂购自通用电气公司[The General Electric （GE） Company （Fort Myers， Florida， USA）]， 乙腈、甲醇和甲酸均为Merck公司（Whitehouse Station， NJ， USA）的色谱纯试剂。其他分析试剂购自国药集团化学试剂有限公司。 　　1.2 动物处理 10只雄性SD大鼠180～200 g，购自上海市公共卫生临床中心动物中心。所有的大鼠实验通过单位伦理审核且获得上海市公共卫生临床中心的伦理批文，饲养在温度控制的房间里，且保证12 h白天与黑夜交替。所有大鼠自由进食，随机分为2组，每组5只包括单独服用EFV组（命名为EFV）， 同时服用EFV和唐草片（命名为EFV-0T）。EFV和唐草片的用药剂量分别为54，864 mg?kg-1。实验前大鼠被禁食过夜（12 h），单次用药，给药1 h后正常喂水和食物，12 h后使大鼠安乐死，肝脏用于微粒体分离。 　　1.3 微粒体分离 按照文献报道的方法[5-6]稍作修改后进行微粒体的分离，大鼠安乐死后，剪碎肝组织，用生理盐水反复冲洗去除血液，同时去除结缔组织。然后加入2倍体积的匀浆缓冲液（100 mmol?L-1 Tris-HCl （pH 7.4， 4 ℃）， 0.15 mol?L-1蔗糖， 25 mmol?L-1 KCl， 5 mmol?L-1 MgCl2和20 mmol?L-1蛋白酶抑制剂，用Ultra Turrax T8 （Janke and Kunkel， IKA Labortecnik， Staufen， Germany） 匀浆器匀浆。匀浆液经 2 400 ×g离心10 min去除未破碎的细胞、细胞核和细胞碎片，收集上清；15 000×g，4 ℃离心10 min，收集上清；100 000×g，4 ℃离心60 min，沉淀即为微粒体；用PBS洗涤2次，12 000×g，4 ℃离心 20 min收集沉淀。沉淀储存在-80 ℃冰箱内以便后续实验使用。 　　1.4 CYP450酶的鉴定 从以上分离的微粒体中提取蛋白质，每只大鼠100 μg微粒体蛋白质用SDS分离，考马斯亮蓝G250染色。按照文献报道的方法[5-