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严格厌氧微生物甲烷古菌分离纯化实验改进 　　摘 要：目的：探索和改进分离纯化严格厌氧微生物甲烷古菌技术。方法：稀释滚管分离法。结果：对厌氧消化器中甲烷菌进行富集、多次稀释滚管分离获得甲烷菌纯培养。结论：稀释滚管分离培养技术方法可靠，分离的效果好，适用于各种严格厌氧微生物的分离纯化。 　　关键词：甲烷古菌； Hungate除氧系统； 富集； 滚管分离； 纯培养 　　中图分类号：Q939文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2014）04-170-003 　　厌氧微生物的分离是黔南民族师范学院微生物课程开放性实验项目之一。目前国内高校多数实验室对严格厌氧菌分离纯化主要采用焦性没食子酸法、厌养罐法、厌养培养箱法等[1]。焦性没食子酸法进行厌养菌分离培养,由于其方法简单，操作容易,在大专院校微生物实验教学中仍广泛使用,但操作过程厌氧条件不易控制，特别是对严格厌氧的甲烷古菌分离效果差。厌养罐法能够为厌氧菌生长提供严格厌氧的环境，但不能为整个分离纯化操作过程提供厌氧环境，使用受到限制。厌养培养箱法虽然能为厌氧菌分离培养提供严格厌氧环境，需要特制设备,在厌氧箱中操作也不方便，由于价格昂贵，因而其应用受到一定限制。为此，为了改进厌氧细菌的分离纯化方法，结合对厌氧消化器中甲烷古菌的分离与纯化开放性实验，借助Hungate除氧系统进行稀释滚管分离，收到了很好的效果，现将有关技术介绍如下。 　　一、材料用具 　　1.接种物 　　取自黔南民族师范学院微生物实验室厌氧发酵缸（厌氧消化器）底部的沉积物。 　　2.仪器用具 　　 2.1Hungate除氧系统。Hungate除氧系统由高纯氢气、高纯氮气，铜柱，加热套，不锈钢分支管，橡皮胶管，注射器及9号针头等组成。铜柱结构直径30～50mm、长300～500mm的石英玻璃管，两端加工成漏斗状，便于连接胶管，玻璃管中装入碎铜丝（长10～20mm，直径0.5mm），压紧，铜丝下面垫上玻璃纤维以防止碎铜丝散落，上端留出50mm左右的空间。铜柱外缠绕加热带，铜柱顶端用胶管与具有分支的不锈钢通气总管连接。不锈钢总管下的各分支管用橡皮胶管连接，橡皮胶管的另一端连接1mL塑料质注射器，注射器再与9号针头连接（图1）。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　图1Hungate厌氧操作系统示意图 　　2.2其它器具。高压灭菌锅，恒温水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜，厌氧管（16×160mm），厌氧瓶（100mL），光波炉，3000 mL三角瓶，各种规格的注射器（1mL、2mL、5mL）等。 　　二、方法 　　1.获取无氧N2、H2、CO2气体 　　甲烷菌是严格厌氧微生物，都能利用H2和CO2合成CH4，一般分离甲烷菌都用H2和CO2作为营养。其分离过程需要人工保持一个无氧环境进行操作和供其生长繁殖。用于分离严格厌氧微生物使用的气体虽然是高纯气体（99.999%），但仍然含有微量的O2，利用Hungate铜柱除氧系统可除掉这些微量的O2，提供和保持无氧环境。 　　2.铜柱除氧与还原 　　铜柱除氧原理：实验使用的高纯气体（N2、H2、CO2）中含有微量的O2，当气体经过铜柱时，这些气体中的微量O2与Cu反应生成CuO（O2＋Cu→CuO），从而流出铜柱的气体则为无O2气体。 　　铜柱还原：铜柱使用后，里边的Cu被氧化为CuO不能继续与O2发生化合反应，失去除氧能力。此时，关掉其它气体，通入H2，同时使铜柱升温（达350℃），当H2通过高温铜柱时，铜柱内CuO与H2反应（CuO＋H2→Cu＋H2O）生成单质Cu，CuO在加热条件下（350℃）被H2还原为Cu，铜柱恢复除氧能力可反复使用。 　　操作步骤：打开Hungate铜柱除氧系统通气橡皮管的通气开关（止水夹），开启H2钢瓶，H2气流通过铜柱，从铜柱里流出的H2用橡皮管引出室外。此时接通电热套电源，铜柱升温，温度达到350℃左右，20～30min后，铜柱内的碎铜丝被H2还原，由黄黑色变为纯铜铮亮色，当铜柱里面的水蒸气被排出完全后，关闭H2钢瓶，铜柱还原结束。 　　3.获取无氧N2、H2和CO2气体 　　无氧N2用于厌氧菌分离操作和培养过程中驱赶空气，保证局部无氧环境。在铜柱还原结束后，立即打开N2钢瓶，气流大小控制以针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意控制气流的大小。此时铜柱内的碎铜丝处于还原状态的单质铜，当通入高纯N2（99.999%）时，其中所含的极微量氧与单质铜反应，氧被固定下来（形成CuO），流出铜柱的则是无氧N2。利用无氧N2气流驱赶厌氧管、血清瓶等培养容器和培养基中的空气，以及挑菌时保证无氧环境。使用完毕后，先关紧N2钢瓶，接着用止水夹封闭所有橡皮管。无氧H2、CO2的获取方法操作步骤相同。 　　2.