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利用噬菌体多肽库筛选卵巢癌细胞特异性结合肽 　　【摘要】目的：利用噬菌体7肽库进行体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands，BRASIL），从而获得卵巢癌细胞株HO-8910细胞表面特异性结合肽。方法：以中国仓鼠卵巢细胞株CHO为吸附细胞，卵巢癌细胞株HO-8910为靶细胞，利用噬菌体展示技术联合差减筛选策略，经过连续5轮生物淘洗，随机挑选13个噬菌体单克隆进行DNA测序，利用噬菌体竞争结合实验、ELISA实验、细胞免疫染色、细胞免疫荧光、合成多肽的竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体的亲和性及特异性。结果：筛选出的噬菌体NPMIRRQ与卵巢癌细胞株HO-8910有较高的亲和性及特异性。结论：阳性噬菌体表面展示的多肽NPMIRRQ可能为卵巢癌的早期诊断和转移复发监测提供新思路。 中国论文网 /6/viewhtm　　【关键词】卵巢癌；噬菌体展示技术；噬菌体多肽库；体外快速差减筛选技术；多肽 　　【中图分类号】R737【文献标志码】A 　　卵巢癌位于妇科恶性肿瘤死亡之首＼[1＼]。据统计，全球每年卵巢癌的发病率达12.7/100000＼[2＼]。目前，临床上主要通过血清CA-125水平和妇科超声检查来诊断卵巢癌。然而，CA-125在多种恶性肿瘤和良性疾病中亦有升高＼[3＼]，其作为卵巢癌诊断指标在灵敏度和特异度方面均存在显著局限，而超声检查也只能起辅助诊断的作用。因缺乏可靠的诊断指标，目前高达75%的卵巢癌患者在确诊时已经为晚期或已发生转移＼[4＼]，其五年生存率更是不足30%＼[5＼]。如何尽早诊断卵巢癌提高患者的生存率成为专家学者们研究的重点问题。 　　噬菌体展示技术目前被认为是筛选肿瘤细胞表面特异性结合肽的强有力、高通量的一种生物学技术，最先是在1985年Smith等＼[6＼]首先创立并在Science杂志上发表，其将噬菌体随机肽库与靶标吸附，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，用宿主菌洗脱结合的噬菌体，进行扩增，经过3～5轮的循环，高度富集与靶分子特异结合的噬菌体，然后进行序列测定，获取其相应的功能、结构等信息。本文以中国仓鼠卵巢细胞株CHO为吸附细胞，以卵巢癌细胞株HO-8910为靶细胞，差减筛选卵巢癌细胞株HO-8910细胞表面分子结合肽，并鉴定其亲和性及特异性，从而获得卵巢癌细胞特异性结合肽，展示利用噬菌体进行卵巢癌诊断的技术。现汇报如下。 　　1材料与方法 　　1.1研究材料 　　1.1.1肽库及试剂选用美国New England Biolabs公司的噬菌体随机肽库（Ph.D-7TM phage Display Peptide library），文库滴度、随机多样性分别为2×1013 pfu/mL、1.28×109。受菌体为E.coli ER2738，-96gⅢ sequencing primer（5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3）。选用earthox公司的抗M13单抗（GE Healthcare）、HRP-抗M13单抗（GE Healthcare）以及FITC标记的兔抗鼠IgG。 　　1.1.2细胞来源选自上海拜力生物科技有限公司的卵巢癌细胞株HO-8910，上海中科院的宫颈癌细胞株Hela、胰腺癌细胞株PANC-1以及上海瑞鹿生物科技有限公司的中国仓鼠卵巢细胞株CHO。 　　1.2方法 　　1.2.1差减筛选制作DMEM无血清培养液，内含1%BSA，将HO-8910与CHO细胞重悬于其中，至细胞数为1×107/mL时取CHO细胞100μL，其中10μL加至肽库中，调节温度4℃，旋转孵育2h，30 rpm/min。孵育后加入200 μL环己烷、邻苯二甲酸二丁酯分离液中，两者体积比例为1∶9，10000 g、4℃离心10min；吸出水相里未结合的噬菌体肽库与100 μL HO-8910细胞于4℃共同孵育3 h；无菌手术刀片切下EP管的底部，取出有机相内沉淀物，其为能与HO-8910细胞结合的噬菌体，转移沉淀物至新的EP管中；另加入大肠杆菌ER2738 200μL，在37℃下孵育30min，对与HO-8910细胞结合的噬菌体进行复苏。对淘洗后的噬菌体进行测滴度、扩增、纯化，进入下一轮差减筛选。将每一轮淘洗及扩增的噬菌体数记录下来，计算回收率（淘洗前后噬菌体滴度的比值）。 　　1.2.2DNA测序第五轮淘洗噬菌体的平板中随机选取13个蓝斑，扩增后提取DNA进行DNA序列分析，得出多肽序列。 　　1.2.3竞争结合实验将所得7种噬菌体进行扩增和纯化，测量其滴度，对照组为M13K07噬菌体。将7种噬菌体分别于M13K07噬菌体1：1混合，滴度为5×109 pfu，混合后置于100μ