兴国红鲤精液超低温冷冻保存效果分析.docVIP

兴国红鲤精液超低温冷冻保存及效果分析 　　摘要：对兴国红鲤精液的超低温冷冻保存技术进行了研究。以解冻后精子的寿命和运动力为参数，分别探讨了不同组合的稀释液、抗冻剂以及冷冻程序对兴国红鲤精液进行超低温冷冻保存的保护效果。试验结果表明，选用Ringer液为稀释液，8% DMSO为抗冻剂，按照程序-80 ℃平衡15 min，后保存于-196 ℃液氮中，37 ℃水浴100 s解冻，精液解冻激活后镜检，精子活力达到（83±9.6）%，寿命在（86.25±24.7） s，接近鲜精的水平。本研究结果为保护淡水鱼类的种质资源提供了理论基础。 中国论文网 /1/viewhtm　　关键词：兴国红鲤；精液；超低温保存 　　中图分类号：S965.116 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0277-02 　　收稿日期：2015-03-16 　　基金项目：江苏省科研院所社会公益研究与服务专项（编号：BM2006703）；江苏省水产三项工程项目（编号：K2006-3）。 　　作者简介：丁淑燕（1978―），女，山东烟台人，硕士，助理研究员，主要从事水产种质资源与遗传育种研究。Tel：（025E-mail：dshy7869@。 　　通信作者：葛家春，博士，研究员，主要从事种质资源保藏与利用。Tel：（025E-mail：gjc09@。兴国红鲤（Cyprinus carpio var.singuonesis）别称金狮红鲤，隶属鲤形目鲤科鲤属，是江西省兴国县特有的淡水养殖品种。在渔业生产上具有较广泛的实际应用价值。据史料记载，该鱼已有1 300年的养殖历史，具有体色全红、个体长大、背宽肉厚、肉质鲜嫩、繁殖力强等特点，深受广大渔业工作者欢迎。由于受到长期、密集的人工选育影响以及缺乏科学的选育指导，在形态和生长性状等方面出现了不同程度的衰退[1]。水产生物种质资源的保护关系到水产业的可持续发展。研究兴国红鲤精液的超低温保存，无论从良种的保存还是水产上的实际生产来讲都是很有意义的。本研究通过筛选D-20、Kurokura-1、Ringer液3种稀释液和二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）、甲醇（Meth）3种抗冻剂，并对冷冻保存的精子进行活力测定，旨在探索一套有效的兴国红鲤精子超低温冷冻保存方法。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　试验所用的兴国红鲤取自江苏洪泽水产良种场，充气运回后于笔者所在研究所水池内暂养。 　　1.2试验方法 　　1.2.1精液的采集根据鱼体质量，分别注射催产激素HRH-A2 5 μg/kg、HCG 250 IU/kg、DOM 1.5 mg/kg、脑垂体 5 mg/kg；12 h后，挤压腹部，若有精液流出，即可取精。方法为用干毛巾擦干其生殖孔，轻轻挤压雄鱼腹部，有精液流出，采集至干燥容器中。所采集的精液要求乳白色，无血液、粪便污染。 　　1.2.2精子的形态观察取1滴精液于干净载玻片上，通过自来水流水冲洗调节密度至适中，置于空气中干燥后，加苏木精染色液，后再次置于空气中干燥，再加入曙红染色液，空气中干燥后重新置于显微镜下观察，并进行显微摄影。 　　1.2.3精液质量的测定先用细口吸管吸1滴激活液于载玻片上，对准视野后，用解剖针针尖挑取培养皿中的精液，取出后立即在载玻片上的激活液中搅匀观察，激活液激活后测活力，大于90%用于保存。将精液稀释10 000倍，采用血球计数板计数，统计精子密度。 　　1.2.4稀释液的配制将精液经过不同稀释液适当稀释后，分别与含有16%DMSO、25%甘油、20%甲醇的同种稀释液等体积混合，使其终浓度为5×108 精子/mL，每管400 μL。以不含有任何保护剂的稀释液为对照组。每组试验均重复3次（n=3）。 　　1.2.5冷冻保存方法将配好的精液稀释液迅速按照下列程序进行冷冻保存：（1）两步冷冻：-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存；（2）多步冷冻：4 ℃平衡30 min，-20 ℃平衡15 min，-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存。 　　1.2.6解冻方法与精子激活经过一定时间的冻存，将冷冻管从液氮罐中取出，于37 ℃水浴90 s，用SM试剂（NaCl 2.6 g/L、KCl 0.4g/L、Tris-HCl 2.4 g/L，pH值为8.0）激活，具体激活方法为每900 μL SM试剂加入6 μL解冻后的精液，立即放入显微镜视野下观察精子运动力和寿命。 　　1.2.7精子活力的测定精子活力分别以精子寿命及精子运动力来评价，精子寿命是指精子被激活至绝大部分停止摇摆运动所需的时间。精子运动力指运动精子占全部精子的百分数。 　　2结果与分析 　　2.1兴国红鲤精子的形态观察 　　在400倍光学显微镜下，兴国