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不同抗生素对刺槐遗传转化受体系统影响 　　摘 要： 　　本试验研究了卡那霉素（Kana）、头孢霉素（Cef）、氨苄青霉素（Amp）、羧苄青霉素（Carb）、红霉素（E）对刺槐形成层为外植体的遗传转化受体系统的影响。结果表明：刺槐形成层诱导愈伤时Cef对受体材料伤害最小，抑菌效果最好，浓度为200 mg/L时能完全抑制农杆菌生长；用Kana作为刺槐转基因植株的筛选，刺槐形成层愈伤组织分化时选择剂浓度为100～125 mg/L最佳，生根培养时选择剂浓度为75 mg/L最佳。 　　关键词：刺槐；遗传转化；抗生素；形成层 　　中图分类号：S792.270.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0031-05 　　刺槐（Robinia pseudoacacia L.），适应性强，生长快，材质好，用途广，繁殖容易，是人工造林的优选树种[1]，但其有限的耐盐能力却限制其栽种范围。应用基因工程技术提高刺槐耐盐性是拓展其用于重盐碱地区造林和绿化的重要途径。???们从刺槐中克隆了定位于液泡膜的Na+/H+逆向转运蛋白基因RpNHX1，并构建含35S强启动子表达载体pBI121-RpNHX1用于刺槐遗传转化。 　　在植物遗传转化的多种技术中，农杆菌介导的转化方法因其操作简单、转化率高、拷贝数少等优点成为常用的有效转化方法，广泛应用于双子叶植物的遗传转化[2～6]。应用农杆菌介导法进行植物遗传转化时，一般经过农杆菌侵染、共培养、选择培养、转基因植株再生等多个环节，除侵染和共培养外，其余环节都要用到抗生素作为筛选转化体的抗性选择剂和农杆菌生长的抑制剂，因此研究抗生素对遗传转化受体系统的影响是遗传转化受体系统建立的必经环节[7，8]。不同种类抗生素抑菌效果不同，对受体材料影响也不同，因此抗生素种类选择和剂量方案都需要在实验中加以确定。目前遗传转化中常用的抑菌类抗生素主要有头孢霉素（Cefotaxime， Cef）、氨苄青霉素（Ampicillin， Amp）、羧苄青霉素（Carbenicillin， Carb）、红霉素（Erythromycin， E）等。抑菌类抗生素通常用以防止遗传转化过程中农杆菌过度增殖对植物细胞造成伤害和杂菌污染。选择抑菌类抗生素既要有效抑制农杆菌的生长还要最大限度减少对受体材料的影响。选择性抗生素用于转基因植株的筛选和检测，这类抗生素的选择只能根据转基因植株所携带的抗性基因决定，我们构建的表达载体pBI121-RpNHX1含有编码npt Ⅱ基因（提供卡那霉素抗性），因此本试验选卡那霉素（Kanamycin， Kana）用于转基因植株的筛选和检测。本研究的目的是确定农杆菌介导RpNHX1基因在刺槐遗传转化过程中抑菌剂的种类和最佳剂量方案，以及用于不同阶段进行抗性筛选的卡那霉素剂量方案，为下一步进行遗传转化提供技术支持。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试刺槐为山东农业大学筛选的刺槐耐盐优良无性系W009，2008年定植于山东农业大学林学试验站。农杆菌菌株LBA4404含重组质粒pBI121-RpNHX1具卡那霉素抗性，构建于2012年4月，-70℃保存，其中载体pBI121由山东农业大学教授樊金会惠赠。供试卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素、红霉素购于SIGMA公司。 　　1.2 不同抗生素对农杆菌的抑制作用 　　挑取含重组质粒的LBA4404单菌落于2 mL YEP液体培养基中振荡培养活化（28℃，200 r/min）过夜，取1 mL新鲜菌液接种于50 mL YEP培养基中，培养至对数生长期，3 000 r/min离心5 min收集菌体， 并重悬稀释菌体至OD600值为0.6。取直径1 cm左右刺槐茎段截成3～5 cm小段，用洗洁净水浸泡10 min，软毛刷清洗表面，流水冲洗2 h，在超净工作台上灭菌，70%酒精30 s，0.1%升汞3 min，无菌水冲洗7～8遍，用无菌滤纸吸干表面水分后刮去表皮，取形成层切成0.5 cm×0.5 cm小块，形成层内侧向下贴在培养基表面，预培养24 h后，在超净工作台上取出于菌液中侵染10 min，用无菌滤纸吸去多余菌液，共培养3 d后接入含有抑菌类抗生素的培养基中。7 d观察记录一次，30 d后统计结果。样本容量为40，重复3次，培养温度25℃、空气相对湿度60%、光照8 h/d、光强1 000 lx。 　　1.3 抗生素对刺槐形成层愈伤组织诱导试验 　　将灭菌后的外植体（材料及方法同上）接种于含不同浓度的Amp、Carb、E、Cef的诱导培养基WPM+1.2 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+100 mg/L水解酪蛋白中。对照为不加抗生素。7 d观察记录一次，30 d后统