植物激素对灵菊七愈伤组织中黄酮含量影响.docVIP

植物激素对灵菊七愈伤组织中黄酮含量影响 　　摘要：以灵菊七（Gynura medica）无菌试管苗叶片为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导形成愈伤组织，并进行愈伤组织继代培养。将继代培养的愈伤组织接种于含有不同激素（浓度）组合的愈伤增殖培养基上，以硝酸铝显色法测定其中黄酮的含量。结果表明，在4种愈伤组织增殖培养基上，愈伤组织中总黄酮含量最大值分别达到0.794%、2.112%、1.652%、2.792%。培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L GA最适用于灵菊七愈伤组织中黄酮总量的积累。 　　关键词：灵菊七（Gynura medica）；愈伤组织；植物激素；黄酮 　　中图分类号：S567；Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1450-03 　　药用植物灵菊七（Gynura medica）俗名仙草、长寿草，其在中国福建地区具有丰富资源，在浙江、江苏、安徽等省区也有种植，民间采其植株茎、叶泡茶饮用来防治糖尿病已有较长的历史。黄酮类化合物广泛存在植物体内，具有多种生理功能，是多种中药发挥生理作用的物质基础[1-3]。国内学者对灵菊七的提取物生物活性研究证明灵菊七含有的黄酮类、酚类物质具有抗氧化活性[4]；灵菊七的水、醇提物对糖尿病大鼠有显著治疗作用[5，6]，这些研究显示出灵菊七具有广阔的降血糖药用开发前景。 　　该研究以灵菊七叶片为外植体诱导形成愈伤组织，通过调整培养基中激素种类与浓度，促进愈伤组织合成黄酮类物质，为生物转化法生产灵菊七黄酮提供一定参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　灵菊七植株采自安徽省六安市，经安徽师范大学周守标教授鉴定为Gynura medica Y. K. Yang et J.K.Wu，以此为母本开展组织培养研究，并获得了大量的灵菊七试管苗，以此试管苗作为试验材料[7]。 　　1.2 试验仪器与试剂 　　MLS-3780型高压蒸汽灭菌器购自日本Sanyo Industry公司；BCM-1000型生物净化工作台购自苏州净化设备有限公司；SPX智能型生化培养箱及PQX型多段智能人工气候箱购自宁波江南仪器厂；R-205型旋转蒸发仪购自上海申胜生物技术有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵购自郑州长城科工贸有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司。 　　盐酸、亚硝酸钠、乙醇、硝酸铝等试验试剂均为国产分析纯；玉米素（ZT）、α-萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、赤霉素（GA）等植物激素及琼脂均为国产生物试剂。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 愈伤组织的诱导培养 以MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA为愈伤组织诱导培养基，调节pH至6.0，常规灭菌。取无菌试管苗叶片，切成面积约1 cm2的小块，每个培养皿接种10块。置于人工气候箱中（光照周期12 h，26 ℃，2 000 lx）进行愈伤组织的诱导培养，接种后每天观察愈伤组织诱导情况。 　　1.3.2 愈伤组织中黄酮的增殖培养 将愈伤组织进行多次继代培养，每次继代培养周期为12 d。按2.0 g/瓶，把愈伤组织分别接种于不同激素组合的固体增殖培养基（表1）上（40 mL/100 mL三角瓶），通过检测愈伤组织中黄酮含量考察不同激素对愈伤组织中黄酮生物合成的影响。置于人工气候箱中（培养条件同诱导培养），接种后每2 d取样一次，测定细胞增长量、总黄酮含量（均以干重计）。 　　1.3.3 芦丁溶液标准曲线回归方程的建立 精确配制0.1 mg/mL的芦丁标准溶液，6个10 mL容量瓶中分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准溶液，再分别加入体积分数70%的乙醇5 mL、5% NaNO2溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入质量分数10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min，然后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，再用蒸馏水定容，摇匀后放置15 min，于510 nm波长处测定其吸光度，绘制标准曲线。 　　1.3.4 愈伤组织中总黄酮的提取及含量测定 称取适量愈伤组织，按料液比1∶30加入体积分数70%的乙醇溶液，50 ℃水浴回流2 h，过滤后将滤液旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，再用体积分数70%的乙醇溶液准确定容。按“1.3.3”中方法检测愈伤组织中总黄酮的含量并进行统计学分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 灵菊七愈伤组织的诱导 　　取灵菊七无菌试管苗叶片（图1），接种在培养基MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上，进行愈伤组织的诱导。ZT显示出了强烈的促进作用，在