实验七 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳.docVIP

实验七 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳实验目的1、进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳的原理。2、熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。3、掌握正常人血浆脂蛋白的分类。二、实验原理琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%-99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。 血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在，各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。 将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离，通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。此法应用于高脂蛋白血症的分型。三、器材和试剂器材：电泳仪、电泳槽、离心机、水浴锅、染色盘、微量注射器、滤纸、镊子剪刀、2cm*8cm玻璃片试剂⑴巴比妥缓冲液（PH8.6）：称取巴比妥钠15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g,加水溶解后，再加蒸馏水定容至1000ml（PH为8.6，离子强度0.075），作为电极缓冲液。⑵苏丹黑染色液：将苏丹黑0.5g溶于无水乙醇5ml中至饱和。⑶凝胶缓冲液：称取三羟甲基甲烷（Tris）1.212g，EDTA0.29g及Nacl5.85g,用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml。调PH至8.6.⑷琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.50g溶于50ml凝胶缓冲液中，再加水50ml，在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。⑸新鲜血清（无溶血现象）四、操作步骤1、预染血清 血清0.2ml加苏丹黑染色液0.02ml与试管中，在混合后置于37℃水浴染色30分，然后离心（2000r/min2、制备琼脂糖凝胶板 已配制的0.5%琼脂糖凝胶于沸水浴（或微波炉）中加热融化，用10ml吸管吸取约3ml凝胶溶液浇注在载玻片上，静置约半小时后凝固（天热时需延长，可放冰箱数分钟加速凝固）。3、点加预染血清 在已凝固的琼脂糖凝胶板距一端2cm处，用自制打孔器（在小玻璃片的两面固定两片小胶片）垂直打入凝胶后立即取出，然后用胶片剥出长方小条凝胶。用小片滤纸吸干小槽中的水分，注意不要损坏槽边缘的凝胶。最后，再用微量注射器吸取经过预染的血清约20ul注入凝胶板上的小槽内。4、电泳 将加过血清的凝胶板平行放于电泳槽中，样品放于负极一端。用两层滤纸或纱布于巴比妥缓冲液浸湿，然后轻轻紧密贴在凝胶板两端，纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中，接通电源，电压为100-120V，每片电流为3-4mA，约经电泳40-60分，可见分离脂蛋白色带。