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不同浓度6BA对黑麦草种子出愈率影响 　　摘要：研究了不同浓度6??BA对多年生黑麦草4个品种夜影、蒙特利Ⅲ、高帽和德比极品的种子愈伤组织诱导率的影响。结果表明，在一定的浓度范围内，6??BA 能够提高多年生黑麦草愈伤组织的出愈率，但随着浓度的增加反而会降低黑麦草愈伤组织的出愈率。夜影品种愈伤组织诱导的浓度为0.1、0.3 mg/L；诱导德比极品品种愈伤组织的浓度为0.2、0.3 mg/L都适宜；诱导蒙特利Ⅲ品种成熟种子愈伤组织的浓度以0.1 mg/L为佳；高帽品种成熟种子诱导愈伤组织的浓度为0.1、0.2 mg/L。 　　关键词：多年生黑麦草；种子；6??BA；愈伤组织诱导 　　中图分类号：S 54文献标识码：A文章编号：1009??5500(2014)03??0020??05 　　 　　 　　多年生黑麦草(Lolium perenne)属冷季型禾草，由于其为异花风媒传粉禾本科植物，高度自交不亲和，优良基因难以纯合稳定下来，这使其遗传改良困难而复杂，用传统的方法育种，耗时费力，困难大，难以取得突破性进展。因此，组织培养和遗传转化技术的发展为多年生黑麦草的遗传改良开辟了一条新途径。1975年，Dale\[1\]首先通过茎尖分生组织培养获得了可育的多年生黑麦草再生植株。Spangenberg等\[2\]首先用基因枪转化法得到黑麦草转基因植株。近年来，有利用基因工程培育和改良黑麦草品种的研究报道，且愈伤组织可以作为基因枪法和农杆菌介导转化法的受体，因此，对愈伤组织培养的研究是十分必要的\[3\]，获得高质量的愈伤组织才能够为进一步的诱导分化和生根提供物质前提\[4\]。 　　目前，国内以黑麦草成熟种子为外植体的研究中，曾升坚等\[5\]得出，在MS培养基中附加8 000 mg/L的2,4??D和0.025 mg/L的6??BA时诱导率最高。而徐定炎等\[6\]认为，黑麦草成熟种子愈伤组织诱导率最高时6??BA 浓度为0 mg/L；吴莲蓉等\[7\]筛选出黑麦草成熟种子愈伤组织诱导的最佳组合为：0.05 mg/L的6??BA浓度+黑麦草品种特高+CC基本培养基。杨茹等\[8\]通过试验认为，2,4??D浓度在7 mg/L、6??BA浓度为0.1 mg/L时有利于多年生黑麦草成熟种子诱导产生愈伤组织；杜雪玲等\[9\]通过试验表明，2,4??D为5 mg/L，6??BA为0.05 mg/L时，黑麦草各品种愈伤组织的质量和诱导率最高；代亮等\[10-12\]的研究表明，基因型的差异会导致品种对6??BA的敏感度不同，在愈伤组织培养时需要谨慎使用6??BA。多年生黑麦草组织培养条件的影响因素依然是一个亟待研究的重要课题。因此，选取不同品种的多年生黑麦草成熟种子为外植体，研究不同浓度6??BA 对多年生黑麦草愈伤组织诱导的影响，并试图找到6??BA 最佳浓度及能产生高出愈率的黑麦草基因型（品种），为多年生黑麦草组织培养及遗传转化打下基础，培育和筛选出我国草业生产所需的抗逆性强的优质多年生黑麦草草种。 　　1材料和方法 　　1.1供试材料 　　选取夜影（Evening shade,E）、蒙特利Ⅲ（MontereyⅢ,M）、高帽（Top hat,T）和德比极品（Derby Xtreme,Dx）4个抗性良好的多年生黑麦草品种。 　　1.2外植体的消毒与接种 　　将适量的各个品种的多年生黑麦草种子置于离心管中，加入次氯酸钠溶液（活性氯7%，约50 mL）和2滴Tween??20，振荡消毒40~50 min，然后用无菌蒸馏水清洗6次以上\[13\]。放置于4 ℃冰箱2~3 d。再次用无菌蒸馏水清洗3次，滤纸滤干水分后直接接种。 　　1.3培养基的配置 　　以MS基本培养基为基础，加入3 g/L植物凝胶或8 g/L琼脂，30 g/L蔗糖，调节pH至6.0，高压灭菌15 min（121 ℃），观察其他因素对愈伤组织诱导的影响。 　　MS基本培养基：MS大量元素+MS微量元素+MS铁盐+MS有机成分。 　　愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+6??BA+4.0 mg/L 2,4??D＋0.1 g/L水解酪蛋白（AHC）+0.1 g/L肌醇+蔗糖30 g/L+8 g/L琼脂。 　　6??BA浓度梯度为0、0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L。 　　 　　1.4愈伤组织诱导 　　将经过消毒处理的4个多年生黑麦草品种的种子，在无菌操作台上，接种到不同6??BA浓度梯度的培养基中，每个培养皿接种40 粒种子，用塑料薄膜封口，置于25~26 ℃的避光培养条件下进行愈伤组织诱导培养。出芽后，待芽长至2~3 cm，将芽从基部拔断去除，将种子留在培养基上，在25~26 ℃避光培养。 　　1.5试验处理 　　附加了4.0 mg/L 2,4??D的MS基本培养基上，设置