第一节DNA和RNA提取与纯化.pptVIP

mRNA分子 原核生物和真核生物的mRNA在结构上有所不同： 1) 原核生物的mRNA是多顺反子的，真核生物的mRNA是单顺反子的； 2) 原核mRNA 5端无帽子结构，真核mRNA 5端有一段帽子结构（m7GpppNmpNmp-）； 3) 原核mRNA 3端无PolyA，真核mRNA 3端有PolyA。 mRNA分子 含量少，单链分子大小不一，也能形成茎环结构。 mRNA是蛋白质生物合成的模板。 每一种蛋白质都有对应的mRNA，种类多。 2、真核生物mRNA的分离 （1)得到总RNA后，可用oligo(dT)-纤维素层析法提取mRNA[poly(A)+RNA ]. 其原理是大多数真核mRNA 3’端带有足够长的多聚腺苷酸残基，可通过其与挂有寡聚d(T)的纤维素亲和形成稳定的RNA－DNA杂合链，不含polyA的RNA从介质中洗去后，应用低盐缓冲液解离双链结构，并从介质中洗脱poly(A)+RNA, 从而使mRNA得以纯化。这些相异的mRNA分子合起来，实际上编码了细胞内所有的多肽。有柱层析的方法和批量层析两种。 （2)提取mRNA的另一种方法是包被抗生素蛋白链菌素的聚乙烯磁珠法 其优点是可以直接从含异硫氰胍的裂解液中分离mRNA。 在典型的实验中，组织、细胞或细胞悬液用硫氰胍裂解，将带生物素的oligo（dT）引物直接加入裂解液，放置一段时间，使引物与细胞mRNA poly(A)尾杂交，然后加入交联抗生素蛋白链菌素的磁珠。抗生素蛋白链菌素抓住带生物素的oligo(dT)+复合物，使它们附于磁珠上，然后用磁体将磁珠从裂解液中回收，以便用高盐溶液洗涤磁珠。最后，用水将poly(A)+mRNA 从磁珠上洗脱，用乙醇沉淀收集。用磁珠法获得的poly(A)+mRNA与传统的oligo(dT)-纤维素层析相当或更多。 最大的优点是操作快，配体结合仅需几分钟，磁力分离只需几秒钟，洗涤和洗脱在大多数时候仅需5min或更短的时间完成。 但磁珠法有两个最大的问题： （1）一次只能处理最多1g组织或细胞， （2） 磁珠昂贵。 三、核酸浓度纯度和相对分子质量的测定 广泛用于测定制备物中核酸的质量的方法有两类。 1若样品较纯时，可通过分光光度法测定碱基吸收紫外线的量，既简便又准确。 其原理是由于核酸是在260nm处有强吸收的化合物。 常用260nm和280nm处吸收光度的比值检查DNA和RNA制品中蛋白类杂质的污染程度。 由于DNA和RNA的比吸光系数均受溶液中离子强度和PH值的影响，因此只有在仔细控制PH值且离子强度较低时才能测定准确。溶液体积小时吸光度难以测定。该方法仅在很窄的浓度范围内可靠（5－90μl/ml）。 定量： 一般根据260nm处的读数可计算出样品中的核酸浓度， 1 个OD值相当于约50μg ／ml双链DNA、40μg ／ml单链DNA和RNA及33μg ／ml单链寡核苷酸。 纯度： DNA和RNA纯制品的OD260：OD280值分别为1.8 和2.0，若样品中蛋白或酚的污染严重则OD260：OD280较低。 OD260／OD230应大于2.0，在230处的强吸收则提示污染有酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物。对于DNA制备，如果OD260／OD280大于1.9则说明有RNA污染。小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260／OD230 小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 纯的RNA溶液 OD260：OD280的比值应介于1.7-2.0， OD260／OD230应大于2.0。 RNA样品OD260／OD280的比值小于1.7， 说明有蛋白质或苯酚污染。比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍等污染。OD260／OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质。 2若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多的杂质，则可通过溴化乙锭或Hoechst33258发出的荧光估测核酸含量。（不常用，如需要可查《分子克隆》） 3 DNA质量的电泳测定 在一般分子标记试验时要通过琼脂糖电泳结合分光光度分来对DNA质量进行检测。 植物总（核）DNA样品在琼脂糖电泳时呈现一条迁移率很小的整齐条带，如果有拖尾情况（即溴酚兰前有弥散的荧光区出现）则表明样品中存在着RNA杂质，如果电泳时不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明DNA已严重降解，提取失败。 在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响， 使超螺旋(SC)的共价闭合环状结构的质粒DNA的 一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链 发生断裂则形成线状DNA(L)分子. 三种构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下， 超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最 慢的为开环状分子。 4 DN