ⅳ 酶的提取与分离纯化.pptVIP

※SDS（ 1.电泳速度只与网孔大小（分子筛效应）有 关原因 SDS与蛋白质结合，破坏三级结构二硫键，与蛋白质形成复合物，该复合物短轴均为18埃左右，长轴与M有关：M越大→长轴越长，长度差距很大， M越大→长轴越长，在凝胶中受到阻力越大，电泳速度越小 2.作用：测M M与电泳速率有关： 可以通过测电泳速率得M ※等电点聚焦电泳 1.原理：两性离子载体加入到电泳池中，两 电极通电后，正极到负极PH依次增 大，不同蛋白质PI不同，PH=PI时的 地方该蛋白质带电量为零，聚集于 此，可用于分离不同的蛋白质 2.两性离子载体： ㈥萃取分离 一 有机萃取 1.原理：利用不同物质在有机溶剂中溶解度 不同而分离 2.作用：用于分离有机物与无机物 二 双水相萃取 1.双水相的制备方法 高聚物与高聚物：相互有排斥力，不成单相 高聚物与无机盐：有机物与无机物不成一相 2.原理：利用不同物质在双水相中溶解度不 同而分离 3.优点：可直接从细胞中提取酶，不用处理 细胞残片；可室温下操作，利于工 业化生产 三 超临界萃取 1.原理：超临界流体作萃取剂，利用不同物 质在超临界流体中溶解度不同而分 离 2.超临界流体：T、P超过临界值形成的流体 ，性质介于气相与液相之间 3.CO2作萃取剂原因：CO2临界点易达到， CO2 的超临界流体易制取 4. CO2作萃取剂优点：CO2无毒、不腐蚀、价格低 、可循环利用 四 反胶束萃取 1.原理：利用正胶束与反胶束转换分离出酶 2.定义 表面活性剂：极性基团与非极性基团组成的有机物 正胶束：表面活性剂在水等极性溶剂中极性基团在 外形成的胶束 反胶束：表面活性剂在有机溶剂等非极性溶剂中非 极性基团在外形成的胶束 3.萃取过程：表面活性剂加入到发酵液中，形成反胶束，蛋 白质溶于水进入反胶束极性中心，再把反胶束 转入水中形成正胶束，极性中心外露，蛋白质 溶于水 ※几个英语单词的意思 一 酶的下游加工流程 1.预处理 2.细胞过滤分离 3.酶提取 4.酶分离纯化 5.酶浓缩、结晶、干燥 6.酶保存 7.酶制剂成型 ※酶工程下游技术操作条件 二 预处理 1.加热：使温度达到最适温度 2.凝聚，絮凝 3.加酸碱：达到最适PH 三 细胞过滤分离 1.细胞破碎法 ⑴机械破碎法：研磨、搅拌、匀浆 ⑵物理破碎法：温度差法、压力差法、超声 波空穴效应 ⑶化学破碎法：酸碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜 ⑷酶破碎法：加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培 养，使溶酶体破裂自溶 2.过滤方法：加压、常压、减压过滤法 ※空穴效应：超声波使发酵液中产生许多小气泡， 气泡破裂产生内爆力使细胞破碎 四 酶提取 1.本质：使胞内酶溶解到发酵液中，使酶出 细胞 2.方法：盐溶法，有机溶剂溶解法，PH远离 PI 3.条件：T：0oC-10oC PH：酶活力范围内，远离PI 提取液体积：酶液体积的2-5倍 ※酶工程下游技术操作条件 T：0-10oC低温 PH：根据要求,远离或趋近PI 加酶活保护剂：有机溶剂提取、沉淀分离时 防酶失活 五 酶的分离纯化 沉淀分离 膜分离 离心分离 层析分离 电泳分离 等电点分离 ㈠沉淀分离 一 盐析法 1.原理:高浓度(NH4)2SO4中和蛋白质表面电 荷,使同电相斥作用减小凝聚沉淀 2. 二 等电点法沉淀分离 1.原理:PH=PI时,带电量为零,同电相斥作用 最小,凝聚沉淀 2.注意：等电点法不破坏水膜，不一定沉 淀，须与其他方法联合使用 三 有机溶剂沉淀法 1.原理:有机溶剂破坏蛋白质三级结构,使非 极性基团外露,极性基团内藏,使水膜 破坏,凝聚沉淀. ㈡膜分离法 一 压差膜法 1.纳滤： 2.微滤： 3.超滤： 二 电位差膜法（电渗法） 1.定义：用两块膜把水槽分为三个室，加空 间电场，使中间室中待分离液中正、 负离子分别电渗到两边的两室 2.注意：正离子向靠近负极的室电渗 负离子向靠近正极的室电渗 三 扩散膜法 1.定义：将待分离液装入膜袋中，