实验三 HPLC.pptVIP

实验三 芳香族化合物的定性、定量分析—高效液相色谱法 1 实验目的 了解并掌握高效液相色谱法的分离原理 学习并掌握高效液相色谱仪的操作 掌握保留时间初步定性和外标法的定量方法 学习使用Empower Pro中文版色谱工作站处理数据 2 实验原理和仪器结构 2.1 高效液相色谱法分离原理 高效液相分配色谱法有反相或正相色谱法两种分离模式。反相高效液相色谱法是指采用非极性固定相（如C18等）、极性溶剂（如甲醇等）作为流动相的一种分离模式。正相色谱法与反相色谱法相反，它是以极性固定相（如带有氨基和氰基的固定相），非极性溶剂（正己烷等）为流动相的一种液相色谱分离模式。极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的固定相上的相互作用较弱，分配较少，因此随着流动相较快流出，反之，疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用，在柱内保留的时间相对较长。 HPLC分离的机理 2.2 仪器流程 3 实验仪器设备、试剂、溶液和实验用品 3.1 仪器 高效液相色谱仪：美国WATERS 600高压泵，WATERS 2996型二极管阵列检测器和Rheodyne 7725i六通阀进样器；Empower Pro中文版色谱工作站；BS210S型电子分析天平；100 μL微量进样器。 3.2 试剂与样品 甲醇（99.9 %）：色谱纯；水：二级水；苯（99.5 %）、甲苯（99.5 %）、二甲苯（99.0 %）均为分析纯；试样。 3.3 溶液 苯、甲苯和二甲苯混合标准工作溶液（约30 ?g/mL）；试样溶液。 3.4 实验用品 每小组按4人计，容量瓶：100 mL 1只（共用）；具塞刻度试管：10 mL 5支；移液管：0.1 mL 3支（共用）、1 mL 1支（共用）。 4 高效液相色谱仪的操作条件 流动相：甲醇?水=75?25； 流动相流速：0.8 mL/min；氦气鼓泡脱气； 色谱柱：Waters C8 (150 mm?4.6 mm?5 μm)不锈钢柱； 定量管：20 ?L； 柱温：25 ℃； 检测波长范围：195 nm ~ 400 nm； 提取波长：254 nm； 采样速率：1.0； 分辨率：1.2 nm； 仪器控制：自动曝光； 3D数据采集； 保留时间：苯：约3.0 min；甲苯：约3.8 min；二甲苯：约4.7 min。 5 实验步骤 5.1 标准工作溶液和试样溶液的配制 先取少许流动相置于100 mL容量瓶中，放入天平中去皮归零，用移液管分别量取0.1 mL苯、甲苯、二甲苯于容量瓶中并依次称重，精确至0.0001 g，然后用流动相定容制备成标准溶液母液。取标准溶液母液0.3 mL用流动相稀释定容至10 mL即配制成约30 ?g/mL的苯、甲苯、二甲苯标准混合工作溶液。 试样溶液由实验课教师配制编码并分发给各实验小组。 5.2 开机测定样品 5.2.1 使用HPLC级流动相，必要时自行制备；水为二次蒸馏水。用前均需过0.22 μm滤膜。 5.2.2 流动相脱气：打开氦气（99.999 %）高压钢瓶，调节减压阀输出压力0.5 MPa。确认流动相管线和相对应的脱气管线。开始洗脱前，以100 mL/min的速率脱气至少15 min，然后以20 ~ 50 mL/min速率维持脱气，直至分析工作完成。 5.2.3 开机：顺序接通WATERS 2996、600。打开计算机电源，进入WINDOWS XP，启动Empower Pro中文版色谱工作站。 5.2.4 排除泵室气泡：当正常工作流速时显示无压力或压力波动时，此时一般要排气。方法是打开排液阀，设置流速10 mL/min，待排出气泡后恢复原有设置。 5.2.5 双击配置系统，建立分析项目。双击运行样品，创建方法组。根据实际分析的样品和要求，设置WATERS 600泵和检测器的工作参数。顺序点击设置、进样按钮，准备开始分析。 5.2.6 进样：将六通阀手柄置于LOAD状态。用微量进样器装样，注入5倍于定量管体积的试样溶液；装样后将手柄顺时针置于INJECT状态开始进样，同时会听到蜂鸣声及屏幕提示，这时工作站开始记录。待进样后2 ~ 3 min，将手柄转回LOAD位置，这时才能取下进样器，装样准备开始下次分析。注意必须使用液相色谱仪专用进样器，避免损坏阀片，造成漏液。在规定的高效液相色谱分析条件下，待基线平稳后，连续注入数针标准混和工作溶液，直至相邻两针的峰面积变化小于1.5 %时，按照进样规则的顺序（标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液）进样分析。本实验先对苯、甲苯、二甲苯单标溶液逐一进样分析，确定苯、甲苯、二甲苯的各自相对保留时间。接下来用苯、甲苯、二甲苯标准混