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极耐高温木聚糖酶的Eudragit?木聚糖酶助漂?极耐高温木聚糖酶的EudragitS-100固定化及其对不同纸浆的助漂作用作者简介:李里特先生,教授;主要研究方向:中国传统食品,酶工程,果蔬保鲜及生物制浆等.李里特朱运平江正强艾志录李秀婷(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083)研究论文摘要:以溶解性可以通过pH值进行调节的EudragitS-100为载体,对海栖热袍菌的极耐高温木聚糖酶B(XynB)进行固定化,并对固定化酶的性质进行了测定,初步研究了固定化酶对浆料的助漂效果.结果表明,XynB经固定化后,酶活回收率高达90%,且对原酶有纯化作用,固定化酶达到电泳单一带的纯度.固定化酶与游离酶相比,最适温度提高了5℃,达95℃,温度稳定性也有较大提高.可溶性固定化酶能有效作用于不溶底物,纸浆经固定化酶处理后释放出大量的还原糖,浆料卡伯值均有不同程度降低,表明固定化酶应用于纸浆助漂有很大潜力.关键词:耐高温木聚糖酶;海栖热袍菌;固定化;纸浆预漂;Eudr~itS一100中图分类号:TS745文献标识码:A文章编号:0254-508X(2005)07-0001-05木聚糖酶可应用于食品,医药,造纸等行业,近年来受到广泛关注.由于在利用木聚糖酶对纸浆进行预漂时,纸浆漂白的环境为温度较高的偏碱性环境,这就需要所用木聚糖酶具有耐热和耐碱的特性_lj.许多嗜热菌产耐热木聚糖酶基因都被克隆和表达在大肠杆菌中,基因重组酶表现出很高的热稳定性.本研究中将极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的第2个木聚糖酶基因,即XynB基因克隆并在大肠杆菌中表达,该酶具有很高的pH值和热稳定性,在100oC下,pH值为6.5～8.5内都很稳定,在纸浆预漂应用中有较大潜力L2J.将该酶应用于生产需要解决的问题之一是提高效率,降低成本,将游离酶进行固定化则对该酶的应用有更大意义.由于固定化酶具有可反复利用的优点,因此,对其的研究受到越来越多的关注.当作用底物是不溶性固体物质时,固定化酶难以与底物充分接触,很难发挥其催化效率,固定化酶的应用在一定程度上受到了限制.若采用可溶性物质作为载体,就可以解决这一问题【3.EudragitS一100由甲基丙烯酸和甲基丙烯酰甲酯聚合而成,是一种溶解性可逆的聚合物载体,pH值高于5.5时溶解,pH值低于4.5时沉淀.Eu—dragitS-100的溶解一沉淀可逆特性使得其在应用时表现出独特的优势:酶与底物接触充分,只需调节pH值就可回收等_5j.EudragitS一100利用吸附,包埋和共价结合的原理进行固定化,反应条件温和,有利于提《中国造纸》2005年第24卷第7期高酶活回收率[6.引.目前,国外有报道采用EudragitS-100进行固定化的研究,固定化效果较好,酶活回收率可以达到80%,国内还没有相关报道.本实验中以EudragitS一100为载体,对XynB的固定化进行了研究,并对固定化酶应用于纸浆预漂实验进行了探讨.1原料与实验方法1.1原料未漂蔗渣浆和麦草浆由中国制浆造纸研究院提供,烧碱一AQ法制浆,卡伯值分别为26.8和21.6;未漂针叶木硫酸盐浆为德国进口浆板.卡伯值为34.6.EudragitS—lO0(RhSmPharma,德国产),羟基苯(甲)酸酰肼(Fluka),Silicagel60F2.~(Merck),硫酸卡那霉素Amresco,USP级),TritonX一100(Amresco),异丙基一一D一硫代半乳糖苷(删),燕麦木聚糖(Sigma).其余试剂均为国产分析纯试剂.1.2游离酶的制备游离酶的制备按参考文献[2]的方法进行.1.3固定化酶的制备将5gEudragitS一100加入到90mL蒸馏水中,用3mol/L的NaOH溶液调pH值至ll.当Eua,-~itS一100完全溶解时,用3mol/LHCI调pH值至7.0,蒸馏水定容至100mL得到5%的EudragitS一100溶液,于4℃下储存备用.为了找出载体浓度对固定化效果的影收稿日期:20O5—0l一24(修改稿)本项目为国家863项目(2003AA21,~r20).研究论文响,采用不同浓度的载体进行固定化.244u木聚糖酶液加到5mL的EudragitS.100溶液(0.1%～2%)中,在25℃水浴摇床中反应3h,摇床转速为150r/rnin,反应结束后,加入1mol/L醋酸溶液调pH值至4.5,室温下静置20min,在离心力118N条件下离心10min.所得沉淀用pH值为4.5的醋酸钠盐缓冲液洗2次,再溶解在pH值为6.1的柠檬酸缓冲液中(50retool/L),定容至5mL,得到溶解状态下的固定化酶.将所得固定化酶沉淀溶解在pH值为6.1的柠檬酸缓冲液(200retool/L)中,然后加人NaC1