核酸综合实验.pptxVIP

【实验目的】;【原理】 ;;;碱裂解法原理（关键）;溶液I 悬浮细胞 EDTA 破坏细胞壁 和细胞外膜;质粒DNA与染色体DNA的分离 在 NaOH 和溶菌酶破除细胞壁后，使 DNA（包括质粒 DNA 和基因组 DNA）释放出来。在强碱条件下， DNA 变性成单链，当加入醋酸（钾）溶液（ pH4.8 ）适当中和 pH 时，质粒 DNA 能很好地复性，而染色体 DNA 和大分子 RNA 仍为单链，并以蛋白质 -SDS ( 十二烷基硫酸钠 ) 复合物形式被高浓度盐沉淀。 质粒 DNA的纯化 质粒 DNA留在上清，可进一步用酚 : 氯仿 : 异戊醇抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀质粒 DNA，低离子强度的TE 缓冲液溶解后，加适量 RNase A 降解残留的小分子RNA 。 ;　　　　【实验步骤】;? 加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置10min质粒DNA复性 ? 15000rpm，离心5min，取上清400ul到一新管 ? 加240ul异丙醇，混匀，室温静置10min ? 15000rpm，离心10min，弃上清 ? 50ul TE溶解沉淀，加入50ul 冰预冷的5M LiCl，混匀，冰浴 10min ? 15000rpm，离心10min，取上清100ul到一新管 ? （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀） ? 上清加2倍体积（200ul）的无水乙醇（充分混匀），-20℃ 10min ?;15000rpm，离心10min ? （可省略）沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心） ? （可省略） 15000rpm，离心10min ? 晾干沉淀 ? 沉淀用20ul TE溶解，-200C保存;【注意事项】 ;载体质粒DNA结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位;限制性内切酶（restriction endonuclease）指能识别碱基构成特异的一段（4~8 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。;载体的酶切与载体的构建;酶切体系;3.琼脂糖凝胶电泳原理;琼脂糖凝胶实验原理 ;琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 ;常用染料;质粒 DNA 的存在形式有 3 种： ① 共价闭环 DNA ，常以超螺旋形式存在； ② 开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂； ③ 线性 DNA ，因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。 ;琼脂糖凝胶电泳可???鉴定质粒 DNA ，在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度不同。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 ;琼脂糖（1%）凝胶电泳 称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解； 溶液冷至60 ℃，加入 EB至终浓度为0.5μg/ml，混匀，注意戴手套操作； 将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡； 待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面1mm； 在DNA样品（１０－３０ul）中加入5 ul loading buffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为100V,15min； 根据指示剂的位置，判断是否终止电泳; 在紫外灯下／凝胶成像仪上观察电泳结果。 ;【注意事项】;【综合实验结果与讨论】; 图1 图2 图3 图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。图3的结果较好。 ;【补充】结果不佳的可能原因分析：;;