固相析出分离法ppt课件.ppt

第五章 固相析出分离法;目的： 浓缩； 初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。; 固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。; 盐析法 有机溶剂沉淀法 固相析出法 等电点沉淀法 结晶法 其它多种沉淀法;第一节 盐析法 第二节 有机溶剂沉淀法 第三节 其它沉淀方法 第四节 结晶;第一节 盐析法;定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 优点：简单、经济、较少变性 缺点：分辨率不高；沉淀含大量盐析剂，要除盐；产生氨的恶臭;两种现象： 盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大 盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小;*;*;一、基本原理;盐析作用（salting out）原理;logS=?-Ks? S——蛋白质溶解度，g/L； ?—盐离子强度, Ci——i离子浓度，mol/L； Zi——i离子化合价； ?——常数,为纵坐标上的截距; Ks——盐析常数。;两种类型： （1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 （2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。 由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，后期分离（结晶）;二、影响盐析的因素;盐析用盐的选择 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济;盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 （1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好， （4）不易引起蛋白质变性。;不同种类蛋白质——所需的无机盐量不同 先后加入不同量无机盐—分级沉淀蛋白质;盐析分布曲线;蛋白质浓度不同：所需无机盐用量不同 蛋白质浓度高：所需无机盐量少 制成品：可适当高浓度，但浓度过高，易共沉淀 重叠蛋白分级：适当稀释，共沉淀小，但回收率降低。;无机或稀盐溶液：T↑蛋白质溶解度↑ 高盐溶液： T↑蛋白质溶解度↓ 蛋白质：室温盐析 对温度敏感的酶，0?C~4?C;5.pH：;三、盐析操作;盐析用盐量的表征--饱和度：;调整硫酸铵溶液饱和度计算表;盐析方法： 1）分步盐析法(不同的盐浓度) 2）重复盐析法 高蛋白质浓度下共沉淀→重复盐析提高纯度 3）反抽提法(相同盐浓度);分级盐析法 不断提高盐浓度：不同蛋白质分级沉淀 低饱和度：除杂蛋白，高饱和度：沉淀目的物;单酶盐析曲线;反抽提法 共沉淀→较低浓度盐溶液溶杂蛋白;防止“局部过浓”：慢加，搅拌 温度：不宜过低，室温10~25?C，易失活：0~10?C 时间：沉淀需经一段老化时间（1小时）后分离;第二节 有机溶剂沉淀法;概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。;优点： 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 2）溶剂易除去 3）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点： 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 2）操作要求在低温下进行。 3）成本高，需防火防爆 总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。;一、基本原理;一些溶剂的介电常数 ;二、影响沉淀效果的因素;常用：乙醇、丙酮（挥发肝毒性着火点低）和甲醇（口服毒性） 介电常数：无水乙醇24，甲醇33，丙酮22 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 用量：（了解）;2.pH的影响 Pl附近、稳定性 控制溶液pH时务必使溶液中大多数蛋白质分子带有相同电荷，勿使目的物与杂质带异电荷导致共沉淀。;严格控制低温 有机溶剂与水混合时产生放热反应 预冷（有机溶剂-10℃以下，蛋白质0℃左右）， 在冰盐浴中进行， 加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓变性，并散热。 温度影响有机溶剂对蛋