仪器分析hplc复习版1011ppt课件.pptVIP

第三章高效液相色谱分析HPLC 高效液相色谱法以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒很细的固定相以及高压泵输送流动相建立的一种液相色谱法 §3-1 高效液相色谱法的特点 高压 150-350×105 Pa 高速 比经典LC快数百倍,流速可达1～10mL·min-1 高效 大于30000塔板/米 高灵敏度: 10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 所需试样量很少:微升试样足以全分析 试样不被破坏，易回收,分析重现性好 应用范围广泛 可分析80%有机化合物，尤适于高沸点、热不稳定、 相对分子量大(﹥400)有机及生化试样的分离分析 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性、沸点较低的样品， 占有机物的20% HPLC：试样不需气化，只需制成溶液，即可在室温下进样分析 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、高沸点、热稳定性差及生化样品、高分子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% HPLC与GC差别 2．流动相的区别 GC：流动相为惰性气体 对组分无亲合作用，仅起运载作用。 HPLC：流动相可选用不同极性的液体 与组分有亲合作用力，通过参与固定相对组分 作用的竞争，提高柱的选择性、改善分离度， 为选择最佳分离条件提供了极大方便。 流动相种类较多，选择余地广， 改变流动相极性和pH值对分离起到调控作用， 选用不同比例的两种或两种以上液体 作为流动相可增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC： 较高温度下进行 HPLC：室温； 高压（液体粘度大，峰展宽小） 高效液相色谱法的主要缺点: 仪器设备费用昂贵 操作严格 一、速率理论 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 §3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 1、涡流扩散项及其影响 讨论： 降低固定相粒度可提高柱效 2、传质阻力项及其影响 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍， 故降低传质阻力是提高柱效主要途径 Hm为流动相对板高影响项 Hsm为固定相微孔内流动相对板高影响项 Hs为固定相（液）对板高影响项 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质 室温（25%左右） 改变流动相组成、极性是改善分离最直接的因素 1、流动相及其流速的选择 二、分离条件的选择 2、 3.固定相及分离柱的选择 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm） 首选化学键合相，湿法匀浆法装柱 高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备 4．洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品） 一、 液-液分配色谱LLC和化学键合相色谱CBPC 固定相与流动相均为液体（互不相溶） 流动相：亲水性固定液，采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定液的极性（正相 NPLC） 流动相的极性大于固定液的极性（反相 RPLC） 正相与反相的出峰顺序相反 固定相—化学键合固定相 §3-3 HPLC的主要类型及其分离原理 正相色谱主要用于极性物质的分离测定 反相色谱主要用于非极性、中等极性物质的分离测定 二、 液-固吸附色谱（LSC） 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等， 较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂 流动相为液体，固定相为固体吸附剂 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样， 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾 三、 离子交换色谱 固定相：强碱性和弱碱性阴离子交换树