2015年研究生实验4 电泳及紫外.pptVIP

* * * * * * * * * 2015级研究生生化与分子生物学技术 银 巍 yinwei@mail.sysu.edu.cn 生物化学教研室 1. 重组质粒的酶切后的电泳鉴定(P28) 2. 紫外分光光度法检测DNA含量 (P37) 实验二 原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 * 1、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶电泳 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 实验材料及试剂 琼脂糖 电泳缓冲液：1?TAE 10 ?加样缓冲液 EB染色液 实验步骤 1、胶带封制胶板两端； 2、放好梳子，今天插2个梳子,等胶稍稍冷却后灌胶； 3、待胶凝固后撕去胶带，将制胶板放在电泳槽中，轻轻的拔掉梳子； 4、加样：每排第一个孔加 DNA marker 10 μl （酶切组：酶切质粒20ul和4μl loading buffer在胶带上混匀上样） (对照组：用酶切前的质粒10ul和2μl loading buffer在胶带上混匀上样,每组1个)； 5、接通电源，开始电泳（80V，1H）; 6、蓝色条带快到终点时停止电泳，EB染色5min，洗脱3min； 7、漂洗后紫外灯下观察结果。 * 实验小结 结果分析与讨论 ①酶切前后的对比？ ②质粒构型对结果的影响？ ③重组质粒的浓度是多少？纯度怎样？ 试验中还有哪些问题没有解决？ * 点样孔 细菌基因组DNA OC 型质粒DNA L型质粒DNA SC 质粒DNA 细菌RNA 质粒电泳图谱 ① 超螺旋DNA(SC DNA) 质粒的三种构型 * ② 开环DNA(open circular DNA,OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。 * ③ 线状DNA(linear DNA,LC DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系 SCLCOC * 电泳结果分析 M：Marker 1：酶切样品1 2：酶切样品2 3：酶切样品3 4：未酶切质粒 M 3 2 1 1Kb 200bp 100bp 2Kb 5Kb 600bp 400bp 4 二、紫外分光光度法检测DNA 2.1 分光光度技术 2.1.1 概述 分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。 * 2.1.2 特点 ①灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L ②准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差2～5％ （1～2％）; ③操作简便快速; ④应用广泛。 * 2.2.2 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律 透光度百分比 T: T% = I0 / It 光密度 D，是光被吸收的程度: D = lg1/T = lg(I0/It) * Lambert-Beer定律 D＝K C L 吸光度 摩尔消光系数 吸收物质的光径（cm） 溶液浓度（mol/L） * 2.4 紫外分光光度法检测DNA 2.4.1 紫外分光光度法检测DNA的原理 原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度