色谱分离过程ppt课件最终版讲解.pptVIP

评价色谱柱好坏的标准 1）理论塔板数n 2）拖尾因子Tf 3) 色谱柱批与批之间的重现性 4）pH值的适用范围 5）使用寿命 拖尾因子Tf 不对称因子 (As) = B A A 拖尾因子 (Tf) = A + B 2A 10% 峰高 5% 峰高 对理想检测器的要求 高灵敏度； 适用范围广，对所有组分都有响应； 温度、流动相流速的变化对响应没有影响； 可梯度洗脱，响应与流动相的组成无关； 死体积小； 使用方便、可靠、耐用； 线性范围宽； 响应时间快； 常用检测器 紫外检测器（UV） 荧光检测器（FD） 示差折光检测器（RID） 蒸发光散射检测器（ELSD） 紫外检测器（UV） 配置最普遍； 主要用于检测具有π-π、p –π共轭结构的化合物，如芳烃、稠环芳烃等； 灵敏度高； 可用于梯度洗脱 缺点： 只能检测有紫外吸收的样品；（衍生化解决） 对流动相的选择有一定的限制；（截止波长） 荧光检测器（FD） 适用于能产生荧光的化合物； 主要用于氨基酸、多环芳烃等样品； 灵敏度极高（比紫外高1~3个数量级），适用于痕量分析； 可梯度洗脱 缺点： 许多化合物不产生荧光（可衍生化解决）； 示差折光检测器（RID） 通用性好； 对糖类分析灵敏度尚可； 缺点： 灵敏度低（比紫外低3个数量级）； 不能梯度洗脱（否则，基线会漂移） 蒸发光散射检测器（ELSD） 20世纪90年代新开发； 是示差折光检测器的理想替代品，对葡萄糖最小检出量5 ng； 高灵敏； 可梯度洗脱； 缺点： 对有紫外吸收的样品，检测灵敏度较低； 检测器比较 紫外 荧光 示差折光 蒸发光散射 测量参数 吸光度 荧光强度 折射率 质量 类型 选择型 选择型 通用型 通用型 梯度洗脱 可以 可以 不可以 可以 最小检出量 约1 ng 约1 pg 约1 μg 0.1~10 ng 凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过色谱、排阻色谱） 原理：分子筛作用 葡聚糖凝胶（sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20) 凝胶过滤色谱 离子交换树脂法 原理：可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂 从柱上洗脱下来，实现物质的分离。 吸附规律 阳离子交换树脂—分离碱性成分 阴离子交换树脂—分离酸性成分 大孔吸附树脂 吸附性和分子筛性原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂（非极性） 吸附性：范德华力或氢键 工艺流程：树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的解吸→树脂的清洗、再生。 分配色谱 原理：被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同。 正相分配色谱：流动相极性 固定相极性 反相分配色谱：流动相极性固定相极性 HPLC、MPLC、LPLC 4.色谱分离过程理论基础 随着色谱技术的发展，为了解释色谱分离现 象，指导色谱技术的发展，许多研究者对色谱基 础理论进行了不懈的研究，提出了多种色谱过程 的理论。主要有速率方程理论、平衡色谱理论、 塔板理论、轴向扩散理论。 4.色谱分离过程理论基础 塔板理论 由马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出 将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间被固定相占据，而另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，其分离效果就越好。 4.色谱分离过程理论基础-保留值 保留时间（t R）：从进样到某个组分的色谱峰顶点之间的时间间隔 死时间（t M）：不被固定相滞留的组分从进样开始、通过色谱柱、到出现峰最大值所需要的时间。 调整保留时间（t R ＇）：t R＇= t R－t M 保留值是色谱过程的基本热力学参数之一。在相同的操作条件下，不同的物质有各自固有的保留时间，因此它也是色谱定性的基本依据。 峰宽Wb：色谱峰拐点处的两条切线与基线的两个交点之间的距离； 半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽，为2.35? ； 相邻色谱峰峰顶之间的距离除以此二色谱峰的平均宽度。用R表示： 分离度 定性时要求：R =1.0（相邻两峰分离程度98%） 定量时要求：R =1.5（相邻两峰分离程度99.7%，基线分离，作为完全分离的标准）。 一般将R≥1作为色谱能较好分离的判据。 柱效率 实际工作中，塔板数的计算用下列公式： 而理论塔板数的计算公式为： n = L / H 其中L为色谱柱的柱长； H为理论板高度。