番茄质体转化载体pTom.doc

番茄质体转化载体pTom-GFPaadA的构建 夏蓓蓓 翟军鹏 陈吉裕 张香琴 张兴国* 西南大学园艺园林学院，重庆 40071摘要：关键词： 番茄是世界上重要的蔬菜作物之一。它色泽鲜艳、口感宜人，可鲜食、菜用和加工，能为人们提供多种天然的维生素和矿质元素，因而深受消费者喜爱[1,2]。目前，利用基因工程的方法进行番茄品种性状改良的研究取得了很大的进展，但多停留对核基因组的转化，而核基因组转化中存在位置效应、转基因沉默及外源基因表达量低等问题。自从1990年高等植物烟草的叶绿体转化获得成功以来[3]，质体转化已经在许多物种中获得了成功，且以其独特的优越性成为植物基因工程的研究热点，但除烟草以外，其他植物的质体转化依然难度较大[4]。 质体转化通过同源重组的方式将外源基因定点整合到质体基因组上，因此，质体转化载体具有物种专一性。Daniel等利用烟草质体基因trnA和trnI作为同源重组片段，构建了可用于不同植物的通用质体转化载体（universal vector）[5]。目前已有多种作物利用该载体实现了外源基因在质体中的稳定表达[6]，但是转化效率很低[7]。可见，要解决番茄质体转化的难题，构建番茄物种专一性的质体基因表达载体非常必要。本研究参照已公布的番茄质体的trnI-trnA基因序列设计引物，从番茄基因组中克隆了trnI-trnA基因片段，并以此作为定点整合的同源片段，构建了包含GFP基因、选择标记基因aadA及质体特异性启动子Prrn和终止子TpsbA的番茄质体表达载体，其结果对提高番茄质体转化的效率具有重要的利用价值。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 材料为普通番茄（Solanum lycopersicum L.）品种Ailsa Craig。pVCT2161由本实验室构建。pBio3-GFP、大肠杆菌菌株DH5α等由本实验室保存。pMD18-T载体购自TaKaRa公司。 1.2 方法 参照CTAB法提取番茄幼嫩叶片中的基因组DNA[]。 根据番茄质体的trnI-trnA基因序列（acc#: NC_007898），设计合成一对引物P1: 5’-gtattttggtttgacactgcttcacacc-3’和P2: 5’-gtatcggctaagttcacgagttgc-3’，分别位于TrnI基因的上游和TrnA基因的下游。以番茄的总DNA为模板，采用PrimStar HS DNA 聚合酶（TaKaRa Co.，Japan）进行PCR扩增。扩增条件为：98℃ 1 min，1个循环；98℃ 10 sec， 59℃ 15 sec，72℃ 2 min，28个循环；72℃最后延伸10 min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，再用Taq DNA聚合酶加“A”尾，TA克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以P1/P2为引物对菌落进行PCR筛选，阳性克隆(pMD-trnIA)委托上海博尚生物技术有限公司测序。 对质粒pMD-trnIA和pVCT216均进行Ase I和Sal I双酶切，分别回收2264 bp的小片段和2633 bp的大片段，回收片段经T4 DNA 连接酶16℃条件下过夜连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，对菌落进行PCREcoR I和Sac I进行双酶切鉴定，获得载体pKn-trnIA。载体pKn-trnIA和pBio3-GFP分别经BstX I和Sac I双酶切，分别回收4742 bp的大片段和2197 bp的小片段，连接转化条件同上。对菌落进行PCR筛选双酶切鉴定，获得重组质粒pTom-GFPaadA，载体构建流程见图(2A)。 2 结果与分析 2.1 番茄trnI-trnA基因片段的克隆与序列分析 以番茄gDNA为模板、p1/p2为引物，扩增得到长度约为2 kb的trnI-trnA基因片段（图2B），TA克隆入pMD18-T载体，PCR筛选出阳性克隆，获得重组质粒pMD-trnIA。双向测序结果表明，序列测定结果同GenBank中公布的序列完全相同，全长2041 bp（图1）。将该序列与烟草TrnI-TrnA片段对应区域相比较，两者有5处差异（图1）,不同碱基相差6.1%左右。 2.2 得到了番茄质体基因表达载体 用EcoR I和Sac I对载体pKn-trnIA进行双酶切，结果经1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，得到3548 bp和1349 bp的符合预期大小的条带（图 2C），表明载体pKn-trnIA构建成功。pTom-GFPaadA进行双酶切，结果经1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，得到和2121 bp的符合预期大小的条带（图 2），载体pTom-GFPaadA构建成功。 3 讨论 一般来说，质体基因表达载体具有物种专一性，异质的同源转化载体虽