马铃薯甲虫leptinotarsadecemlineata腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsrna应用研究-study on the application of dsrna gene of potato beetle leptinotarscemlineata adenosine homocysteine hydrolase.docxVIP

摘要马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata(Say)，又称科罗拉多甲虫或科罗拉多马铃薯叶甲，属于鞘翅目的叶甲科，是世界性检疫害虫之一。自20世纪90年代传入我国新疆地区以来，对我国的马铃薯生产构成了严重威胁。本试验通过测试表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶dsRNA(dsSAHase)的大肠杆菌对马铃薯甲虫的干扰作用，研究储存条件对大肠杆菌菌液的影响，并初步探讨马铃薯甲虫体液对dsRNA的降解作用以及稳定剂的开发。研究结果对利用RNA干扰技术开发高效、专一性强、对人畜安全、对环境无污染的新型杀虫剂具有一定意义。研究主要得出以下结论：1、dsSAHase对马铃薯甲虫RNA干扰效应试验结果：通过饲喂法将不同剂量dsSAHase导入马铃薯甲虫体内，运用线性回归方法测算各龄期LC50；同时观测饲喂后成虫的产卵数，解剖观察雌成虫卵巢发育情况。dsSAHase对马铃薯甲虫各龄期幼虫的的LC50分别为：1龄2.341μg/ml，2龄2.552μg/ml，3龄3.450μg/ml，4龄4.968μg/ml。饲喂dsSAHase后，马铃薯甲虫成虫表现为产卵极少或不产卵，其雌成虫卵巢发育等级与产卵情况正相关。dsSAHase对马铃薯甲虫幼虫具有显著致死作用、拒食作用以及抑制生长发育作用，各龄期幼虫的毒力随龄期增长而降低，对马铃薯甲虫成虫的繁殖能力具有显著的抑制效果。2、不同储存条件对dsSAHase生物活性的影响研究结果：将用超纯水悬浮的表达dsSAHase的大肠杆菌E.coil菌体，分为灭活与不灭活两个处理，分别于-20℃、4℃、室温、37℃储存24h、48h、72h，将未脱培养基的表达dsSAHase的大肠杆菌发酵液不灭活，在-20℃和室温条件下储存24h、48h、72h；将各处理大肠杆菌饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫，检测各因素对其活性的影响，明确其储存条件。大肠杆菌脱培养基后低温储存24h后生物活性优于新鲜菌，高温储存24h后仍有较高活性，储存48h后效果减弱；大肠杆菌是否脱培养基在低温下储存对dsRNA活性影响不大，高温下储存影响较大；大肠杆菌脱培养基后储存则温度、是否灭活对活性影响不大。dsRNA大肠杆菌菌体在-20℃、4℃、室温、37℃条件下可以在24h内储存。3、马铃薯甲虫体液对dsRNA的降解作用及聚乙烯亚胺（PEI）对dsRNA的保护作用试验结果：马铃薯甲虫中肠液及淋巴液与dsSAHase在不同温度条件下体外孵育，观测其作用结果；构建聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)PEI-dsSAHase复合物，饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫，观测PEI对dsSAHase的增效作用。马铃薯甲虫中肠液与淋巴液都降解dsSAHase，该降解作用受温度影响较小。单体dsSAHase菌液饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫死亡率为55%，而PEI-dsSAHase复合物饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫死亡率达到75%。dsRNA会被马铃薯甲虫体液部分降解，而PEI与dsRNA结合形成复合物，提高了dsRNA的稳定性，抑制了dsRNA在虫体内的降解。综上所述，马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶dsRNA对马铃薯甲虫低龄幼虫毒力高于高龄幼虫，对雌成虫生殖能力具有一定的抑制作用。dsRNA大肠杆菌菌体可在24h内保存。马铃薯甲虫体液对dsRNA具有显著降解作用，PEI可保护dsRNA，抑制dsRNA在虫体内的降解。关键词：马铃薯甲虫；RNAi；dsRNA；腺苷高半胱氨酸水解酶；保幼激素AbstractLeptinotarsadecemlineata(Say),belongingtoChrysomelidae,Coleoptera,isalsocalledColoradopotatobeetlewhichisonekindofcosmopolitanpestquarantineobject.ItconstitutesacatastrophiccrisisforPotatoProductioninXinjiangsince1990s.ThisexperimentordertotesttheeffectoftheadenosylhomocysteinegenesdsRNA(dsSAHase)asanewscientificresearchtoolappliedinIntegratedPestManagement(IPM).TheyincludetheStorageconditionsaffecttoxiceffectsofE.coliexpressingthedsSAHaseonthepotatobeetle,ThetoxicitymeasurementofdsSAHaseindifferentstagesofpotatobeetles,stabilityofd