男性不育相关蛋白mlh1和mir-383在精子发生中的功能分析-functional analysis of male infertility related proteins ml h1 and mir - 383 in spermatogenesis.docx

摘要男性不育是一个世界范围性的生殖健康问题。更重要的是，近年来研究表明男性不育患者有易发睾丸癌的风险。然而，大部分非梗阻性无精症（NOA）患者的病因不明（特发性不育），且临床治疗有限。一些研究表明减数分裂同源染色体重组缺陷以及生殖细胞增殖凋亡失衡可能是成熟抑制型NOA患者的潜在致病因素。因此，本文的目的是鉴定参与这些病理缺陷发生的调控因子及其途径，并分析是否这一调控因子/途径介导了不育患者的睾丸癌易感性。首先，需要了解正常情况下男性同源重组的调控模式。重组过程涉及同源配对染色体间的交换位点（crossovers，COs，由粗线期MLH1蛋白标记）形成。在人类中，COs的分布受正干涉调控，即一个COs的形成会抑制其它COs在它邻近形成，从而使COs沿染色体分散排布。分析结果表明交换干涉可连续通过着丝粒起作用，且交换干涉水平在个体间、染色体间和染色体内均存在显著的变异，即小号染色体的干涉水平强于大号染色体，而臂间干涉强于臂内干涉。此外，SCs对交换干涉水平大小具有重要的调控作用，这主要表现在两方面：1）交换干涉存在染色体间效应，而这种效应与SCs的长度相关，即两长度类似的SCs上交换干涉水平更易发生相互关系；2）染色体结构异常可影响干涉水平，如9号染色体上出现的不连续区域gaps及未联会区域splits可cis/trans影响其本身和其它染色体上干涉水平。本文首次表明交换干涉水平在全基因组范围内存在显著的异质性，且至少在男性中，染色体联会异常可导致交换干涉水平的改变。其次是鉴定成熟抑制型NOA患者中病理缺陷发生的信号调控途径。microRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码RNA，已有研究报道其在精子发生和肿瘤发生均扮演重要角色。为确定候选的功能性miRNAs，本文首先通过microarray技术筛选正常与不育患者中差异表达的miRNAs，发现154种显著下调及19种显著上调的miRNAs。从中选取下调比较显著的miR-383为研究对象，原位杂交结果显示miR-383主要表达于人精原细胞及初级精母细胞。经real-timePCR分析证实其在精子发生停滞的不育患者中出现显著下调，而这种下调受到转录及转录后水平调控，且与不育患者中生殖细胞过度增殖有关。在睾丸癌细胞系NTera-2cells中沉默内源的miR-383也促进癌细胞增殖及细胞周期G1/S期转变，同时抑制本底凋亡，而过表达miR-383则出现相反效应。进一步实验表明miR-383通过影响mRNA稳定性靶向转录因子interferonregulatoryfactor-1(IRF1)，且miR-383与IRF1在体内存在负相关关系，同时miR-383可抑制IRF1的细胞周期相关靶基因cyclinD1、CDK2及p21表达。沉默内源IRF1或cyclinD1，而非CDK2增强miR-383介导的抑增殖效应。沉默Ip21则对miR-383介导的抑增殖效应起负反馈调控作用。此外，miR-383可通过提高CDK4的蛋白酶体降解抑制其表达，最终导致G1期关键调控因子pRb磷酸化水平降低。这些研究结果表明miR-383-IRF1-pRb途径异常与不育患者中的精原细胞增殖失调相关，且可能参与介导不育患者的睾丸癌易感性。综上所述，本文描绘了正常情况下调控重组交换位点MLH1的干涉模式以及miR-383在生殖细胞增殖方面所扮演的角色，这些结果为进一步探讨NOA患者中同源重组缺陷以及增殖凋亡失衡的原因奠定了基础。关键词：男性不育MLH1同源重组交换干涉miR-383生殖细胞增殖凋亡睾丸癌ABSTRACTMaleinfertilityisaworldwidereproductivehealthproblem.Moreover,recentresearchprovidesstrongevidencethatinfertilemenhaveanincreasedriskofsubsequentlydevelopingtesticularcancer.However,mostcasesofnon-obstructiveazoospermia(NOA)remainunexplained(idiopathicinfertility)andmedicaltreatmenthaslimited.Somestudiesindicatedthatdefectsinmeiotichomologousrecombinationand/orimbalancebetweenproliferationandapoptosisofgermcellsaretheetiologicalfactorsofNOApatientswithmaturationarrest(MA).Thus,thisworkisfocusedonident