犬zfxzfy基因干扰载体构建及性控效果的观察-construction of canine zfxzfy gene interference vector and observation of its sex control effect.docxVIP

万方数据 万方数据 The RNAi vecter Construction and verification of the effects of sexual control from Dog Zfx/Zfy gene A Dissertation Submitted to Shihezi University In Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Veterinary medicine By Ji Junming (Veterinary Technical Services) Dissertation Supervisor: Prof. Jia Bin Sept,2015 本研究由以下项目资助 “兵团科技支疆项目”（项目编号：2014AB012） Science and technology supporting project of Xinjiang Production and Construction Corps (project number: 2014AB012) 犬 犬 ZfxlZfy 基因干扰载体构建及性控效果的观察 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知，除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果.对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意. 研究生签名:先像吨 时间: :;U;I如/}月 4日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 ， 研究生签名:先俊时 导师签名: 时间 :.:;.0 I r 年 11 月y/;目 时间 :)oIS 年 1/ 月功曰 犬 犬 Zfx/Zfy 基因干扰载体构建及性控效果的观察 摘要 动物性别控制技术的相关研究早在多年前就已经开始。目前国际上家畜性别控制技 术方法主要有三种:（1）X 精子与 Y 精子的分离方法。（2）胚胎的性别鉴定方法。（3） 控制家畜受精环境方法。尽管家畜性别控制的方法很多，但由于影响因素较多很难找到 合适的即经济又方便的性别控制方法，在生产上推广应用。如今，随着科学技术水平的 发展，以及对细胞遗传学、分子生物学等理论的深入研究，从基因水平研究控制性别已 经成为一种新的研究方向，同时也使性别控制在生产中应用推广成为了一种可能。 性别控制技术中的性控精液已经广泛应用于奶牛、猪等家畜的生产，而 RNA 干扰 技术在新型的养犬业中还无人研究。RNA 干扰是一种转录后的基因沉默现象且已被证 实和广泛应用。通过体外人工合成或体内产 dsRNA 在细胞内特异性地降解其同源的 mRNA，使得相应的基因沉默，实现阻止目标基因表达的目的。Zfx/Zfy 基因均属于 ZFY(zinc finger-Y)基因家族，Zfx 编码的蛋白作为转录因子，在精子形成过程中具有一 些功能并与精子的发生有关。 本研究拟在前期研究的基础上，构建出犬的 Zfx、Zfy 基因干扰的载体同时进行犬生 精细胞、支持细胞体外培养，将干扰载体转入犬生精细胞，利用实时定量 PCR 检测 Zfx、 Zfy 基因的表达情况，体外验证 RNA 干扰载体的沉默效应，筛选出犬体外有效的 Zfx、 Zfy 基因的 RNA 干扰载体，再利用犬体外 Zfy 基因沉默效应有效的 RNA 干扰载体对犬 进行 Zfx、Zfy 基因体内干扰试验，最后统计其后代性别比例，以此达到研究人为控制犬 性别的目的。具体研究结果如下： 1. 犬 Zfx\Zfy 基因 mRNA 序列（No. XM_005641207\No. JX964866），按照 RNAi 设计原则，针对该基因的编码区各设计并合成 3 对 shRNA 干扰片段。以 pLL3.7 慢病毒 骨架质粒作为载体，成功地构建了 6 个重组表达载体 pLL3.7 xa-xc\pLL3.7ya-yc，经测序 验证，成功构建了表达载体。 2. 将构建好的 6 个犬 Zfx\Zfy 基因 shRNA 重组质粒表达载体进行体外 RNAi 试验。 初步筛选出细胞水平上对 Zfx 基因干扰效果较好的表达质粒载体 pLL3.7-xa，其使 Zfx 基 因表达水平下降了 98.7%，与对照组相比差异极显著（P0.01）。体外干扰试验表明， Zfy 基因 shR