桑树转景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因msbpase的分析-analysis of msb pase gene of mulberry transgenic sedum alfredii - 1,7 - diphosphatase.docxVIP

中文摘要SBPase是卡尔文循环过程中的关键酶，它催化反应处在卡尔文循环中同化与再生的平衡点。此外，SBPase控制着卡尔文循环过程中碳的流量。前人通过对SBPase基因功能的研究发现其具有提高光合性能的作用。转基因植株的叶片内淀粉和可溶性糖含量增加，植物的生长速度和干物质积累量也明显提高，显示了良好的应用前景。桑树基因工程是桑树育种工作的重要组成部分，也是桑蚕行业重要的基础性研究。目前，用于桑树遗传转化的目的基因种类很少，且以抗性基因为主，能够改善桑叶品质、提高桑叶产量的基因国内外尚无报道。有鉴于此，本研究以桑芽为外植体，建立了桑树无菌体系和叶片再生体系，分析比较了不同品种的差异性，并筛选出农杆菌阳性菌株，通过优化影响叶盘遗传转化的各因子，开展了桑树SBPase基因（MSBPase）的遗传转化研究，探讨了稳定高效的遗传转化体系，最终获得了转基因抗性桑芽。主要研究结果如下：1探讨了不同芽位、不同品种、不同季节对启动培养的影响，同时研究不同品种对继代培养的影响，试验结果表明：培养启动培养过程中，桑品种、取材季节、芽位对启动效果的影响均达到显著水平：按启动速度，由快到慢排列顺序为：新桑11号＞新桑13号＞丰田2号＞海宁桑＞丰田6号＞丰田5号；春季桑芽启动效果优于秋季桑芽；芽位以上部芽最优，其次为中部芽、下部芽：桑树最佳启动培养基为：MS+6-BA2.00mg/L+2,4-D0.10mg/L。继代培养过程中，桑品种、激素种类及配比对桑苗生长分化影响极显著：供试桑品种继代生长优劣顺序为：新桑11号＞新桑13号＞丰田2号＞丰田6号＞丰田5号＞海宁桑；激素以6-BA、2,4-D对桑苗生长分化影响最大，其中6-BA对其影响达到极显著水平，NAA不利于桑苗生长分化；桑树最佳分化培养基为MS+6-BA2.00mg/L+2,4-D0.10mg/L，30d时桑苗增值系数为4.6，生长高度达4.8cm。2通过正交试验研究了影响叶片再生的因素，筛选了叶片褐化抑制剂，运用单因素试验确定了桑树生根培养基，试验结果表明：桑品种、叶位、激素配比对叶片愈伤诱导率的影响均达到显著水平：供试桑品种优劣顺序依次为新桑11号＞农桑14号＞新桑13号＞桂桑优12号；叶位为6的叶片愈伤诱导率高于其它叶位；最佳诱导愈伤培养基为MS＋6-BA1.00mg/L＋2,,4-D0.80mg/L；新桑11号叶片愈伤诱导率最高，达95%。在分化培养基MS＋6-BA3.00mg/L＋IAA0.10mg/L中，新桑11号的不定芽分化率最高达87%，不定芽平均数最高达5.47；附加PVP2.0g/L时，新桑11号叶片褐化率最低为3%；新桑11号在生根培养基1/2MS＋NAA0.2mg/L中的生根数最高达5.86。3以新桑11号组培苗为材料，通过单因子试验，确定了遗传转化的最佳侵染浓度、侵染时间、共培养时间、kan筛选浓度、cef抑菌浓度组合，建立了桑树叶盘遗传转化体系。试验表明：菌液侵染浓度以OD600=0.3最佳；感染桑树叶盘以10min为宜；共培养2d最有利于转化；以20mg/L的Kan进行初筛，30mg/L的Kan进行二次筛选，并用400mg/L的Cef抑菌，既可以获得较高的再生芽转化频率，又能得到较好抑菌效果。此转化体系转化效率为10%。4对转化抗性桑芽进行PCR扩增，电泳图谱表明MSBPase基因已经被导入到桑树组织中，桑树转MSBPase基因获得初步成功。关键词：桑树；组织培养；农杆菌；遗传转化；MSBPase基因GeneTransformationofSedoheptulose-1,7-bisphosphatase（MSBPase）inMulberryAbstractSBPaseisakeyenzymeinCalvincycleprocesswhichcatalyzesthereactioninthecalvincycleinthebalancebetweenassimilationandregeneration.SBPasealsocontroltheflowofcarboncycleincalvincycleprocess.PreviousstudiesongenefunctionofSBPaseandfoundthatithaveimprovedthephotosyntheticperformance.Starchandsolublesugarcontentwereincreasedinleavesoftransgenic,whatever,theplantgrowthrateanddrymatteraccumulationweresignificantlyincreased,theseallindicatingagoodprospect.Mulberrygeneticen