球囊菌ascosphaera apis侵染对意大利蜜蜂免疫反应的影响-effect of ascosphaera apis infection on immune response of apis mellifera.docxVIP

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2018-07-29 发布于上海
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球囊菌ascosphaera apis侵染对意大利蜜蜂免疫反应的影响-effect of ascosphaera apis infection on immune response of apis mellifera

独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。□不保密，本论文属于不保密。□学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：目录摘要1Abstract2第一部分绪论31白垩病发生概况32白垩病流行病学33白垩病的鉴定43.1传统鉴定方法43.2分子检测鉴定43.3白垩病的治理54球囊菌54.1A.apis的生态学特征54.2A.apis侵染的蜜蜂病理学研究64.3A.apis孢子剂量与侵染力的关系75蜜蜂的免疫85.1细胞免疫85.2体液免疫95.2.1抗菌肽与信号通路95.2.2酚氧化酶原级联系统105.2.3蜜蜂酚氧化酶结构特征及表达105.2.4蜜蜂酚氧化酶活性的测定126荧光定量PCR技术127本试验目的和意义13第二部分室内人工饲养意大利蜜蜂幼虫及接种球囊菌孢子的研究151试验材料与方法151.1试验材料151.2试验方法151.2.1A.apis的分离与收集151.2.2室内人工饲养意大利蜜蜂幼虫161.2.3A.apis孢子悬浮液的制备161.2.4接种A.apis孢子171.2.5数据统计与分析172结果与分析172.1纯化菌株及产孢菌落形态172.2室内人工饲养意大利蜜蜂幼虫并对其接种A.apis孢子182.3室内人工饲养意大利蜜蜂幼虫及对5日龄幼虫接种A.apis孢子后的累计死亡情况统计202.4A.apis孢子接种剂量与蜜蜂白垩病感染率的关系213小结22第三部分血淋巴中的免疫反应241试验材料与方法241.1试验材料24I1.2试验方法251.2.1A.apis的分离与收集251.2.2室内人工饲养意大利蜜蜂幼虫251.2.3A.apis孢子悬浮液的制备251.2.4接种A.apis孢子251.2.5血淋巴的抽取251.2.6血淋巴内细胞形态观察261.2.7血细胞总数计数（TotalHemocyteCounts，THC）261.2.8黑化反应261.2.9数据统计方法272结果与分析272.1显微镜检查中肠孢子272.2血淋巴内细胞形态观察272.3蜜蜂幼虫体内血细胞总数测定结果282.4接种A.apis孢子对黑化反应的影响293小结30第四部分球囊菌侵染对意大利蜜蜂酚氧化酶原基因表达的影响321试验材料和方法321.1材料321.1.1蜜蜂与菌种321.1.2试剂321.1.3溶液配制331.2仪器332试验方法342.1室内人工饲养意大利蜜蜂幼虫及接种A.apis孢子技术342.2样本的选取342.3总RNA的提取342.4cDNA第一链的合成35PCR检测36PCR反应体系36PCR反应条件362.5.3检测36qPCR定量37qPCR反应362.6.3扩增效率的检测372.6.4qPCR定量372.7数据处理及统计分析383结果与分析383.1RT-PCR结果373.2扩增效率一致性分析383.3qPCR产物特异性分析393.4意大利蜜蜂proPO基因mRNA水平的相对定量分析404小结41第五部分讨论与总结43II参考文献45III摘要白垩病是一种由专性病原真菌蜜蜂球囊菌侵染所产生的蜜蜂幼虫病。球囊菌唯一的侵染途径是以孢子形式经口摄入并在幼虫进入中后肠相通的蛹期这一特殊时期进行侵染。当球囊菌孢子进入蜜蜂体内至完成侵染，以细胞免疫和酚氧化酶为代表的体液免疫在蜜蜂个体免疫中的如何变化是未知的。本试验利用室内人工饲养意大利蜜蜂幼虫及接种球囊菌孢子技术，探究5日龄初的意大利蜜蜂被接种不同剂量球囊菌孢子（1×107、2.5×107、5×107、1×108孢子数/mL）后的白垩病感染率，发现5×107孢子数/mL有效感染率达到90.00±2.55%。在此基础上对被球囊菌侵染的蜜蜂个体免疫反应进行初步探究，检测了蜜蜂血淋巴中血细胞形态、血细胞总数、黑化反应、酚氧化酶原基因的转录表达相对定量分析。结果显示：血淋巴中未出现明显的细胞免疫行为；接种之后24h内的血细胞总数在接种孢子组和空白对照组之间没有差异；接种孢子组的血淋巴黑化反应出现早并且程度深；蜜蜂体内酚氧化酶原基因转录水平随着个体发育的进行呈上升趋势，接种孢子组蜜蜂体内酚氧化酶原基因转录水平的相