沙利度胺对正常及组胺刺激后人真皮成纤维细胞分泌的tgf-β1 mmp-1 timp-1基因表达的影响-effect of thalidomide on tgf - β 1 mmp - 1 timp - 1 gene expression secreted by human dermal fibroblasts stimulated by normal and histamine.docxVIP

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2018-07-30 发布于上海
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沙利度胺对正常及组胺刺激后人真皮成纤维细胞分泌的tgf-β1 mmp-1 timp-1基因表达的影响-effect of thalidomide on tgf - β 1 mmp - 1 timp - 1 gene expression secreted by human dermal fibroblasts stimulated by normal and histamine.docx

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沙利度胺对正常及组胺刺激后人真皮成纤维细胞分泌的tgf-β1 mmp-1 timp-1基因表达的影响-effect of thalidomide on tgf - β 1 mmp - 1 timp - 1 gene expression secreted by human dermal fibroblasts stimulated by normal and histamine

沙利度胺对正常及组胺刺激后人真皮成纤维细胞分泌的TGF-β1、MMP-1、TIMP-1基因表达的影响摘要背景：成纤维细胞是皮肤真皮层最重要的细胞之一，附着在胶原纤维上，可以合成和分泌大量的胶原蛋白，这对于维持皮肤的弹性和韧性有着重要作用[1]。许多疾病的发生与胶原蛋白的代谢异常有明显相关性。有研究表明系统性硬皮病和病理性瘢痕[2]是由于成纤维细胞增殖活性增强和以胶原蛋白为主的细胞外基质过度沉积造成的。细胞因子中转化生长因子-β1(TGF-β1)可以促进成纤维细胞的增殖，刺激胶原蛋白合成，同时可以刺激胶原酶的产生。TGF-β1被认为在瘢痕形成中最重要的细胞因子[3-4],可以强烈促进细胞外基质的沉积。在正常情况细胞外基质的合成与降解保持着动态平衡，以维持组织的正常结构与功能。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)与其抑制因子基质金属抑制蛋白酶(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase,TIMPs)在这种平衡中起着重要作用[5]。MMP-1是基质金属蛋白酶家族的重要一员，在创伤修复中对启动胶原的降解起着关键作用，是胶原降解的关键酶。TIMP-1是MMP-1最重要的抑制因子，可以与MMP-1按比例1:1形成复合体抑制该酶的活性[6]。随着沙利度胺(THD)在麻风、结节性红斑等疾病治疗上取得良好效果，研究发现沙利度胺具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用。目前有实验证明沙利度胺可以通过抑制TGF-β、TNF-α因子对抗肺纤维化的进程[7]。大量实验均已证明肥大细胞分泌的组胺可以刺激成纤维细胞的增殖和胶原合成增多，故本实验用组胺作为成纤维细胞的刺激因子诱导纤维化病理细胞模型。本课题通过体外培养人成纤维细胞，研究沙利度胺对组胺刺激后人成纤维细胞分泌的TGF-β1、MMP-1及TIMP-1的影响。目的：探讨沙利度胺对正常及组胺刺激后人真皮成纤维细胞分泌的TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的mRNA的影响。方法：1使用体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基，通过消化-组织块混合法对人正常真皮成纤维细胞进行原代培养。2通过波形蛋白免疫组化染色进行细胞鉴定。3实验分组实验分为空白对照组（正常成纤维细胞）、沙利度胺组、组胺组、组胺+沙利度胺组。4经前期实验测定，沙利度胺的浓度在10-5mol/L时对正常成纤维细胞的增殖活性无影响，经查阅大量文献，本实验所用的组胺浓度为100UM。采用SYBRGreenI染料法荧光定量PCR测定TGF-β1的mRNA的表达情况及进行统计学分析。按上述分组的要求处理细胞，每组均设三个样本，接种在25mL培养瓶中继续培养。24h后提取各组的总RNA。应用荧光定量PCR对TGF-β1mRNA基因的表达量进行测定，并用以上测得数值进行统计学分析。采用SYBRGreenI染料法荧光定量PCR测定MMP-1及TIMP-1的mRNA的表达情况及进行统计学分析。按方法5得到MMP-1及TIMP-1mRNA基因表达量，并进行统计学分析。结果：1沙利度胺对组胺诱导后人成纤维细胞TGF-β1mRNA的影响。空白组、沙利度胺组、组胺组、组胺+沙利度胺组的TGF-β1mRNA的RQ值分别为0.9837±0.0125、0.849±0.0276、2.5653±0.0935、0.648±0.0321。各组RQ值不全相等(P＜0.05)，组内两两比较时均具有统计学意义(P＜0.05)。结果提示：经组胺诱导后TGF-β1mRNA表达量增加。沙利度胺可抑制正常的人真皮成纤维细胞TGF-β1mRNA的表达，且经过组胺诱导后其抑制作用更显著。2沙利度胺对组胺诱导后人成纤维细胞MMP-1mRNA的影响。空白组、沙利度胺组、组胺组、组胺+沙利度胺组的MMP-1mRNA的RQ值分别为0.9973±0.0074、1.2773±0.0351、1.071±0.0137、1.7523±0.0334。各组RQ值不全相等(P＜0.05)，且组内两两比较时均具有统计学意义(P＜0.05)。结果提示：组胺和沙利度胺可以促进正常人真皮成纤维细胞MMP-1mRNA的表达，经过组胺诱导后沙利度胺对其促进作用更明显。3沙利度胺对组胺诱导后人成纤维细胞TIMP-1mRNA的影响。空白组、沙利度胺组、组胺组、组胺+沙利度胺组的TIMP-1mRNA的RQ值分别为0.997±0.007、0.1687±0.0015、0.9563±0.0312、0.1173±0.005。对各组的RQ值进行统计学分析，四组数据方差不齐。空白组与组胺组相比较没有显著性差异；沙利度胺组较空白组TIMP-1mRNARQ值降低，两者间有统计学意义(P＜0.05)；组胺+沙利度胺组与组胺组相比较RQ降低，两者间有统计学意义(P＜0.05)；组胺+沙利度