蛇足石杉离体叶状体生产石杉碱甲的工艺条件分析-analysis of the technological conditions for producing huperzine a from the isolated leaflike bodies of huperzia serrata.docxVIP

I I 摘 要 本研究以庐山野生蛇足石杉茎尖离体诱导出具有代谢石杉碱甲(抗老年痴呆 症药物)能力的叶状体为研究对象，通过优化培养条件及石杉碱甲提取工艺，筛 选出高产石杉碱甲叶状体株系。基础培养基筛选设计（B5、6，7-V，MS、N6、 White）；用正交实验对植物生长物质浓度进行筛选；蔗糖用量（g/L）设计为 10、 15、20、25、30。光照条件设计为不同光质（红光、白光、蓝光），光照时间（12 h/d ，14 h/d），光照强度(0 lx、1000 lx、1500 lx、2000 lx)。石杉碱甲提取工艺 设计为：酒石酸浸泡培养物干粉时间（12 h、18 h、24 h、30 h、36 h）；酒石酸 浸泡培养物干粉体积（10 mL、20 mL）。采用薄层层析及高效液相色谱法对石 杉碱甲进行定性定量检测。用 Logistic 模型拟合叶状体的生长曲线模型；通过 POD 酶考察其培养过程中相关遗传物质的稳定性。从而为蛇足石杉离体培养产 石杉碱甲技术提供一定的理论基础，本实验研究结果如下： 1.在植物离体培养技术中，培养基配方是细胞增殖的主要因素，本实验结果 表明不加激素的 1/4 MS+20 g/L 蔗糖的固体培养基是叶状体的最佳增殖培养基。 2.光调控是植物离体培养生长及合成次级代谢物至关重要的因素，本试验结 果表明：以白光为主要光源，光照时间为 12 h/d，光照强度 1500 lx 左右的条件 是叶状体增殖产石杉碱甲的最佳光照条件，相对增殖率达到 3174.5%，石杉碱甲 累积量达到 72.45 ug/L。 3.本试验优化的石杉碱甲提取工艺：2%酒石酸浸泡 24 h，超声 30 min，重 复三次，氯仿萃取 5 次，自然风干后甲醇提纯。筛选出氯仿/丙酮/异丙醇/氨水 （4:4:2:0.1，v/v/v/v）薄层层析效果最好；分离效果最佳的高效液相色谱条件： 流动相为甲醇-醋酸铵（0.08 mol/L;pH=6）=3:7，流速:0.8 mL/min，检测波长:308 nm，柱温:25 ℃，进样量：20 μL。 4.在培养条件优化的基础上，探索了叶状体增殖及合成石杉碱甲的动力学， 蛇足石杉离体叶状体增殖的生长曲线呈“S”形，继代周期以50 d左右为最适；60 d 后生长进入稳定阶段，累积石杉碱甲明显加快，直至85 d达到最大值7.453 ug/g， 即叶状体先快速增殖，后累积石杉碱甲。叶状体累积石杉碱甲与叶状体增殖成非 生长偶联型，叶状体增长规律符合Logistic生长模型，最大的比生长速率（umax） 为0.071 / d 。 5.分析不同生长阶段的叶状体 POD 同工酶色谱图，得出叶状体在生长过程 I II 中 POD 酶没有发生变化，随着培养时间增长，条带染色越来越深，在 70 d 达到 最深，说明叶状体的 POD 酶代谢活动在 70 d 相对最高 关键词：蛇足石杉；离体叶状体；石杉碱甲；Logistic 生长模型；POD 同工 酶 PAGE PAGE III Abstract The purpose of this study was to investigate the factors and dynamic varitation rule for the accumulation of Huperzine A(Hup A) from Huperzia serrata (H.serrata) thallus which could produce Hup A , an anti-Alzheimer’s disease drug candidate. Designed five medium (B5、6，7-V、MS、N6,、White) to find which was the best one for thallus. The optimal concentration of plant growth substances for the growth of H.serrata thallus were screened using orthogonal design method, and designed concentration gradient (g/L) (10、15、20、25、30) to find the best sucrose concentration. Studied the optimum light through light wave (blue、white、red)、light intensity (0 lx、 1000 lx、1500 lx、2000 lx) and light time (12 h/d、15 h/d).