水相体系酶法制备溶血磷脂酰乙醇胺及酰基转移机理分析-enzymatic preparation of lysophosphatidylethanolamine in aqueous phase system and analysis of mechanism of acyl transfer.docxVIP

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  • 2018-07-31 发布于上海
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水相体系酶法制备溶血磷脂酰乙醇胺及酰基转移机理分析-enzymatic preparation of lysophosphatidylethanolamine in aqueous phase system and analysis of mechanism of acyl transfer.docx

水相体系酶法制备溶血磷脂酰乙醇胺及酰基转移机理分析-enzymatic preparation of lysophosphatidylethanolamine in aqueous phase system and analysis of mechanism of acyl transfer

郑州轻工业学院学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作出了明确的声明并表示了谢意。本人学位论文与资料若有不实,愿意承担一切相关的法律责任。学位论文作者签名:年月日--------------------------------------------------------------------------------------------------------郑州轻工业学院学位论文知识产权声明书本人完全了解学校有关保护知识产权的规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于郑州轻工业学院。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时,本人保证,毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文章一律注明作者单位为郑州轻工业学院。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名:指导教师签名:年月日年月日摘要溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)是利用磷脂酶A1酶解磷脂酰乙醇胺(PE)失去一个分子脂肪酸后得到的酶解产物。LPE具有重要的医药应用价值,如抗艾滋病毒和肿瘤,脂质体可以作为药物载体,已经被广泛应用于医药行业。随着研究者对LPE药用功能性认识的增加,高纯度LPE产品的研发与应用也备受关注,这与天然LPE的量少相矛盾,目前尚没有高纯度LPE。本研究针对制备高纯LPE过程中存在的转化率低、纯度不高及环保等方面的问题,创建了磷脂酶制取技术和硅胶柱色谱技术相结合的联用技术,同时对其酰基转移机理进行研究。首先建立一种水相体系中磷脂酶A1酶解制备LPE的方法。通过液料比、酶解温度、酶添加量及CaCl2添加量等单因素酶解条件,研究对LPE相对含量的影响。利用正交实验对酶解反应条件进行优化,得出其最佳酶解条件为:液料比10:1、酶解温度为35℃、酶添加量为0.04mL/g,CaCl2添加量为0.01g/mL,最后得出LPE的相对含量达到42.0%。其次建立一种LPE的硅胶柱色谱纯化技术。通过对柱层析过程中混合洗脱液比例、上样浓度、上样量以及洗脱液流速等纯化工艺因素对溶血磷脂酰乙醇胺分离纯化效果的影响分析,确定了最佳纯化工艺参数:洗脱液配比为氯仿:甲醇=2:1、上样量为1:40g/g、上样浓度为30mg/mL,洗脱液流速为2.5mL/min,最终LPE的纯度达到99.05%,回收率88.69%。研究LPE过程中的酰基转移机理。首先利用HPLC-ELSD对磷脂酶A1催化酶解PE的全过程进行分析检测,结果证实了酶解过程有酰基转移现象发生;然后利用HPLC-RID对磷脂酶A1、磷脂酶A2分别酶解磷脂酰乙醇胺的全过程进行分析检测,结果表明酶解过程中Sn-2-LPE发生了自动酰基转移,得到了Sn-1-LPE,并未发现Sn-1-LPE有自动酰基转移现象。同时通过单因素实验探讨了溶液的极性、pH值、酶解温度及Sn-2-LPE的浓度等因素对酰基转移的影响。关键词:磷脂酰乙醇胺;溶血磷脂酰乙醇胺;磷脂酶A1;硅胶柱色谱;酰基转移ABSTRACTLysophosphatidylethanolamineisahydrolyticmaterialbyphospholipaseA1-catalyzedamoleculefattyacidofphosphatidylethanolamine.Lysophosphatidylethanolamine,forhavingimportantmedicalapplications,suchasanti-HIVandanti-tumor,liposomesasdrugcarriers,iswidelyusedinmedicineindustry.Specifically,researchersarebecomingincreasinglyabouttheknowledgeofLPEmedicinalfunction.Therefore,thedevelopmentandapplicationofhigh-purityLysophosphatidylethanolamineisalsohighlyanticipated.Unfortunately,LPEisscarceinnaturalsources,nohigh-purityLysophosphatidylethanolamine.ThecurrentworkdescribedasimplemethodforproducingLPEb

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