医学荧光定量ppt课件.pptVIP

如何设计荧光定量PCR实验方案 不加探针的常规PCR反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件 每次实验都设置阴性对照和标准品，每个样品设两个平行孔 数据分析——基线和阈值的设定 确定正确的基线 设定合适的阈值 注意：同样的实验最好使用同样的基线和阈值，这样可以增加实验的准确性、重复性。但是阈值和基线不能被保存，因此必须记录 基线的缺省值在3～15循环 阈值的缺省值是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍 腹腔热灌注化疗在腹膜假性黏液腺瘤治疗中应用肝功能异常时肠外营养中氨基酸的应用钢球磨煤机顶轴润滑油站系统讲解剖析高密隆运服务顾问和客服思想意识和基础汽车知识话术讲解流程培训高新技术企业与研发费加计扣除政策讲解苏州工业园区地方税务局 主 要 内 容 定量PCR与常规PCR的区别 荧光定量PCR的原理 常用的热循环仪 定量的方法 重复性和敏感度 应用 如何设计荧光定量PCR的方案 荧光定量PCR与常规PCR的区别 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析 荧光定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物 进行定量分析 实时荧光定量PCR的特点 特异性更强 灵敏度高 可直接对产物进行定量 解决PCR污染问题 自动化程度高、操作简单 real time PCR 的扩增曲线 Ct值极具重现性 PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 Threshold 104 103 102 常用的荧光定量PCR试剂 SYBR Green I Taqman水解探针 分子信标 SYBR Green I 结合到双链DNA的小沟部位 只有和双链DNA结合后才发荧光 SYBR Green I 工作原理 未结合的SYBR green I 结合解离曲线识别不同的PCR产物 95 ℃ 15sec; 60℃ 20sec; 95 ℃15sec 在60 ℃ ～95 ℃ 之间的Ramp time设为19:59 SYBR Green I的特点 可以用于不同的模板 使用方便，价格相对便宜 灵敏度很高 与非特异性产物结合 解离曲线 选择良好的引物和探针并优化反应条件 TaqMan Probes 荧光素 淬灭剂 与目标序列互补 FAM TET JOE HEX VIC TAMRA DABCYL TaqMan Probes工作原理 探针与目标序列配对时 ，发生 FRET 光 能量转移 Taq 游离的探针 荧光基团 淬灭剂 延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号 Taq 发出荧光 光 另一波长的荧光 随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系 TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等 其结果都具有高特异性与高敏感性 但只适合于一个特定的目标 TaqMan MGB探针 荧光素 非荧光淬灭基团 与目标序列互补 MGB (Minor Groove Binder) 将探针的Tm值提高10℃ 因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。 TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 分 子 信 标 (发夹型杂交探针) 荧光基团 茎由互补配对的序列组成 环与目标序列互补 淬灭剂 茎(5-7bp) 环（15-30bp） FAM Texas Red 分 子 信 标 工 作 原 理 探针杂交到DNA模板 光 发出荧光 荧光基团 DNA 模板 淬灭剂 茎 环 光 淬灭 分子信标能特异性地检测感兴趣的目标DNA 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 特别适用于检测点突变 只能用于一个特定的目标 设计困难 价格较高 常 用 的 热 循 环 仪 Company PCR system Sample format Max sample number Applied Biosystems ABI Prism 7700 SDS GeneAmp 5700 SDS ABI Prism 7900 HT SDS Microplate Tubes Microplate Tubes Microplate 96 96 96, 384 Bio-Rad iCycl