超滤亲和结合液相色谱―质谱联用和分子对接技术筛选毛菊苣种子中高亲和性α―葡萄糖苷酶抑制剂.docVIP

超滤亲和结合液相色谱―质谱联用和分子对接技术筛选毛菊苣种子中高亲和性α―葡萄糖苷酶抑制剂 　　摘 要 采用超滤亲和结合液相色谱质谱联用（UFLCMS） 和分子对接技术筛选毛菊苣种子中高亲和α葡萄糖苷酶抑制剂。以4硝基苯αD吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物，阿卡波糖为阳性对照，评价毛菊苣种子提取物对α葡萄糖苷酶的抑制活性，其中阿卡波糖IC50为0.003 mg/mL，毛菊苣种子IC50为0.447 mg/mL。利用UFLCMS技术对毛菊苣种子提取物进行筛选鉴定，获得4种化合物； 通过Autodock软件筛选出2种与α葡萄糖苷酶有较高亲和力的化合物，分别是绿原酸和异绿原酸A。结合体外酶活实验，验证了绿原酸、异绿原酸A对α葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，各化合物对α葡萄糖苷酶的抑制活性由大到小依次是：阿卡波糖异绿原酸A绿原酸，其中异绿原酸A与阿卡波糖抑制率相近。 　　关键词 超滤亲和； 液相色谱质谱联用； 分子对接； 毛菊苣种子； α葡萄糖苷酶抑制剂 　　1 引 言 　　目前，从天然产物中发现2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM） [1，2]治疗药物是治疗糖尿病的研究热点之一。α葡萄糖苷酶抑制剂已被广泛用于治疗T2DM，拜唐苹作为α葡萄糖苷酶抑制剂的代表药物，主要成分为阿卡波糖，其疗效已被临床研究和应用所证实。 　　毛菊苣（Cichorium glandulosum Boiss. et Hout） ?榫湛凭哲氖糁参?[3，4]，是维吾尔族医生习用药材，常以地上部分入药，具清肝利胆、健胃消食、利尿消肿之功效[5，6]，被中华人民共和国卫生计生委药食同源药材目录（2015版） 列为“药食同源类”药材。研究发现，毛菊苣具有良好的降糖活性[7]，但目前研究主要集中于地上部分，其种子部位降糖物质基础尚不明确。探索毛菊苣种子（Cichorium glandulosum Boiss. et Hout seed， CGS） 的作用机制，寻找其降糖的物质基础是深入开发毛菊苣种子的关键。 　　传统中药分离方法主要为柱层析、两相溶剂萃取法、系统溶剂分离法等[8，9]。但天然产物组成复杂，分离纯化耗时长，操作复杂[10]。近年来建立的超滤亲和液相色谱质谱联用（Ultra filtration affinityliquid chromatographymass spectrometry，UFLCMS） 技术可在很大程度上克服传统方法的缺点，在药物筛选中显示了良好的实用性和高效性[11]，但采用该技术时仍存在假阳性结果。研究者开发了多种方法减少假阳性结果， 如明胶沉淀法结合在线筛选法[12，13]、多组实验对照法[14， 15]、键和磁珠筛选法[16～18]。 　　为提高筛选质量，本研究对UFLCMS筛选技术进行改进和优化，结合分子对接技术（Molecular docking） 筛选毛菊苣种子中高亲和性的α葡萄糖苷酶抑制剂，为毛菊苣种子的降糖活性物质基础研究提供了参考。本研究的工作流程图如图1所示。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Waters2545型高效液相色谱仪（配2489紫外检测器） 、Xevo TQD质谱联用仪（美国Waters公司） ； 3001型多功能酶标仪（美国热电公司） ； Microcon超滤离心管（YM10，MWCO 10 KDa， 美国Millipore公司） ； Centrifuge5424R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司） ； QL861涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司） ； MiliQ Advantage A10超纯水系统（美国Millipore公司） 。 　　α葡萄糖苷酶（50～120KD） 、4硝基苯αD吡喃葡萄糖苷（PNPG） 、阿卡波糖（SigmaAldrich公司） ； 绿原酸、异绿原酸A对照品（上海源叶生物科技有限公司） ； 甲醇和乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司） ； 其余试剂为分析纯，实验用水为MilliQ超纯水。 　　毛菊苣种子购于新疆维吾尔自治区和田县，经石河子大学药学院韩博副教授鉴定系毛菊苣种子，存放于新疆特种植物药重点实验室药剂学研究室。 　　2.2 毛菊苣种子样品处理 　　称取毛菊苣种子约30 g， 用95%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，合并提取液，稀释至4 mg/mL。将α葡萄糖苷酶冻用10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 6.86）配制成2 U/mL的溶液，用于酶活性分析。 　　2.3 毛菊苣种子提取物的α葡萄糖苷酶活性抑制实验 　　参照文献[19，20]方法，以PNPG为底物，阿卡波糖为阳性对照，测定毛菊苣种子提取物的酶抑制活性。实验分为空白组、阳性对照组、样品组和背