嗜肺军团菌重组蛋白pip-linker-momp的制备及其在血清学诊断中的研究-preparation of recombinant protein pip - linker - momp of legionella pneumophila and its application in serological diagnosis.docxVIP

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  • 2018-08-01 发布于上海
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嗜肺军团菌重组蛋白pip-linker-momp的制备及其在血清学诊断中的研究-preparation of recombinant protein pip - linker - momp of legionella pneumophila and its application in serological diagnosis.docx

嗜肺军团菌重组蛋白pip-linker-momp的制备及其在血清学诊断中的研究-preparation of recombinant protein pip - linker - momp of legionella pneumophila and its application in serological diagnosis

宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是个人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果,无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名_____论文导师签名_____年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文,同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版,允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名_____论文导师签名_____年月日年月日嗜肺军团菌重组蛋白PIP-Linker-MOMP的制备及其在血清学诊断中的研究摘要目的以嗜肺军团菌的pip基因和momp基因构建原核重组质粒pET-plm,诱导表达的PIP-Linker-MOMP(PLM)蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA方法进行血清学检测,评价其在诊断嗜肺军团菌感染中的可行性及应用价值。方法以重组质粒pET-pip和pET-momp为模板,PCR扩增得到pip基因和momp基因,定向克隆至载体质粒pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-plm,并经限制性内切酶、PCR及核酸测序分析鉴定。将构建的原核重组质粒pET-plm转化至大肠杆菌BL21内,经过IPTG的诱导表达,产物通过SDS电泳进行鉴定分析。将纯化的重组蛋白PLM作为包被抗原,通过十字交叉连续稀释分析法筛选出最佳包被抗原的浓度,建立间接ELISA方法,检测32例健康人血清、58例军团病疑似患者中抗嗜肺军团菌抗体IgG、IgM、IgA水平,然后分别与德国DRG公司的LegionellaELISA试剂盒和美国RD公司HumanLPIgG-AbELISAKit/HumanLPIgM-AbELISAKit/HumanLPIgA-AbELISAKit检测结果进行配对设计资料的ROC曲线分析,以此来评价嗜肺军团菌重组蛋白PLM在军团病诊断中的可行性。结果扩增出了嗜肺军团菌723bp的pip基因和830bp的momp基因,构建的重组质粒pET-plm将其基因测序结果提交GeneBank经Blast比对,结果表明表达载体中插入的核酸序列与所选取嗜肺军团菌LP1型菌株的相应核酸序列具有98%的同源性,11个碱基位点发生改变,1个氨基酸位点发生改变,由于两种氨基酸同为疏水性氨基酸以及结构较相似,对蛋白质的空间结构和功能影响不大,对抗原表位基本没有影响。表达并纯化出了67KD左右的融合蛋白PLM,纯化的蛋白浓度达到728μg/mL。用以纯化蛋白PLM作为包被抗原建立的间接ELISA检测方法分别检测血清中Lp特异性IgG、IgM、IgA抗体。与DRGIgG/M/A试剂盒比较:灵敏度92.6%,特异度92.1%,一致性Kappa值I0.821(P0.05),ROC曲线下面积0.923。与ELISA试剂盒(RD)进行比较:IgG抗体灵敏度91.7%,特异度90.9%,一致性Kappa值0.784(P0.05),ROC曲线下的面积0.913;IgM抗体灵敏度90.6%,特异度93.1%,一致性Kappa值0.831(P0.05),ROC曲线下的面积为0.919;IgA抗体灵敏度88.9%,特异度92.1%,一致性Kappa值0.793(P0.05),ROC曲线下的面积0.905。结论成功构建了嗜肺军团菌重组质粒pET-plm,诱导表达并纯化出融合蛋白PLM,纯化蛋白PLM作为诊断抗原对军团病疑似患者血清和健康人血清进行诊断,显示出较好的特异度、灵敏度和一致性,为目前军团病的血清学诊断方法的改进提供了较好的参考价值,为军团病的血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。关键词嗜肺军团菌;pip基因;momp基因;重组蛋白;ELISAIIPreparationofrecombinationPIP-Linker-MOMPproteinandstudyontheserodiagnosisofLegionellapneumophilaABSTRACTObjectiveToconstructtherecombinantplasmidpET-plmwiththepipgeneandmompgeneofLegionellapneumophila,toinduceexpressionoftherecombinantplasmidpET-plmandbuildindirect-ELISAmethodwiththe

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