自然科学荧光PCR同步检测细小脲原体和沙眼衣原体及解脲支原体基因分群分型研究武汉百泰基因ppt课件.ppt

王业富 教授/博导 完成单位：武汉大学生命科学学院 武汉大学病毒学国家重点实验室 武汉百泰基因工程有限公司;主要内容;研究背景;研究背景;实时荧光定量PCR简介;Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 。 荧光域值（threshold）的设定：荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。;实时荧光定量PCR简介;研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。;荧光探针和荧光染料 ; TaqMan探针 ：该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ →3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 ;实时TaqMan荧光定量PCR技术中，TaqMan探针与目标PCR片断上的对应序列是完全互补的，如果目标PCR片断上的对应互补序列上有1个或多个碱基发生突变，那么TaqMan探针将无法和互补序列结合，TaqMan探针将不会被Taq酶酶切水解，因此将不会显示出荧光的累积。这就是TaqMan探针的单核苷酸多态性（SNP）分析功能。 ;TaqMan－MGB探针技术是在TaqMan探针基础上发展起来的一种新技术, TaqMan探针的3′端结合上MGB，即DNA小沟结合物 。其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合,有效提高探针的退火温度 。 TaqMan－MGB探针较TaqMan探针具有更高的敏感性和特异性，是分析单核苷酸突变的有效工具。 ;;利用实时TaqMan荧光定量PCR技术和双重PCR技术，研发出双重实时TaqMan荧光定量PCR反应体系，可以用于临床上快速、高特异性、高灵敏度、精确定量、同步检测细小脲原体和沙眼衣原体；;研究内容;TaqMan探针和引物序列设计;名称;名称;（1）;细???脲原体引物探针在线分析;名称;沙眼衣原体序列比对分析;沙眼衣原体在线比对分析;;; ; ; A B C;荧光PCR反应体系的优化; 右图：The iCycler iQTM 多色实时PCR检测系统可重复性研究结果。;荧光PCR反应特异性研究; 由于细小脲原体和沙眼衣原体双重荧光PCR体系中，引物与探针之间难以避免的相互干扰作用，细小脲原体和沙眼衣原体双重荧光PCR的有效检测范围降低了1－2个数量级，只有101－106拷贝/微升左右。 右图为：双重荧光PCR体系中细小脲原体的荧光曲线和标准曲线图，有效检测范围为 101－106 拷贝/微升。 灵敏度为10拷贝/微升。; 右图为：双重荧光PCR体系中沙眼衣原体的荧光曲线和标准曲线图，有效检测范围为102－106拷贝/微升。 灵敏度为102拷贝/微升。;双重荧光PCR临床标本检测应用; 实时TaqMan荧光定量PCR定量检测与鉴别细小脲原体和解脲脲原体 ;TaqMan-MGB探针和引物序列设计;名称;（1）;阳性对照标准株模板进行常规PCR，使用与实时TaqMan荧光定量PCR反应体系中相同的引物对，以便将常规PCR检测和实时TaqMan荧光定量PCR检测直接进行比较。 ;;阳性对照标准株 PCR产物用于构建克隆。 含阳性对照标准株细小脲原体血清型6和解脲脲原体血清型2目标片断的重组质粒用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别进行双酶切的产物凝胶电泳图 。 A：DNA size marker 622，527，404，309，242，201，190，160，147，123bp B：含细小脲原体目标片断的重组质粒双酶切产物 219（108＋111）bp C：含和解脲脲原体目标片断的重组质粒双酶切产物 218（108＋110）bp ;A7琼脂法：解脲支原体(包括细小脲原体和和解脲脲原体)会形成15μm—100μm的棕黑色海胆状菌落。 培养法不能区别鉴别细小脲原体和和解脲脲原体。;荧光PCR体系的优化;Rotor-Gene实时PCR检测系统可重复性研究结果。以含细小脲原体目标片段重组质粒的104拷贝/微升标准品作为模板，以完全相同的反应体系，同时进行5个并列的实验，得到的荧光扩增曲线图 ; ;用含细小脲原体目标片断的重组质粒108－101拷贝/微