《基因芯片技术在心血管研究中的应用》课件.pptVIP

基因芯片技术在心血管研究中的应用;第一节 基因芯片技术概论;一、基因芯片技术的产生和发展;传统的方法：效率太低，无法满足后基因组研究的要求 高效研究成千上万基因的功能需要高效的方法和工具;生物芯片技术始于20世纪80年代后期，将八聚体寡核苷酸探针固定在尼龙膜上进行杂交， 但由于核酸在尼龙膜上容易扩散，因此在单位面积上的点样密度受到限制。同时滤膜面积较大而需要较多的探针量，故检测灵敏度较低，为了提高点样密度和灵敏度，降低探针用量，人们逐渐发现以玻璃、硅片等材料比传统的膜载体有无法比拟的优点，因此以此为材料的DNA芯片技术应运而生。;1991年，美国Affymetrix公司在玻璃片上原位合成世界上第一张寡核苷酸基因芯片。 1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的世界上第一张直接点样法制备的cDNA芯片。 ;1996 Chee et al：DNA测序 1996 Cronin et al：突变检测 1996 Sapolsley Lipshutz：基因图克隆 1996 Shalon et al：复杂DNA样本分析 1996 Shoemaker et al：缺省突变定量表型分析 目前扩展的方法，包括蛋白芯片、组织芯片等 ;乳腺癌诊断组织芯片;;二、基因芯片技术概论;基因芯片原型 ;;（二）基因芯片的工作原理 基因芯片的工作原理是根据碱基互补配对的原理，标记的待测样本DNA与芯片上特定位置的探针杂交，通过分析处理芯片的杂交检测图像确定靶DNA序列，这样就可对细胞和组织中大量的基因信息进行分析。  ;;;三、基因芯片制备技术;原位合成方法的工作原理;Affymetrix公司研究组首次报道和采用合成高密度基因芯片 ;（二）直接点样法 首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。 ;1. 探针的准备 根据实验的目的，选择相应的探针及种类，基因芯片的探针主要有寡核苷酸或cDNA。 对于寡核苷酸探针，探针的设计是很关键的一个环节，需要根据研究目的设计相应的探针序列，如SNP分析芯片，必须考虑待检测位点的序列和位置，需要严格控制探针的Tm值。如果用于表达谱的研究，目的基因的寡核苷酸探针设计原则是尽量使探针与其他基因之间没有同源性，即探针的特异性要好。???; 对于cDNA芯片，需要预先克隆到大量目的基因的cDNA克隆，并经过测序验证。用PCR进行探针的扩增，经过纯化后，即可用于点样。 ;2．玻片的表面修饰 对于DNA芯片，点样法所用载体多为玻璃片 在点样前，一般先对载体表面进行化学修饰(如多聚赖氨酸或硅烷偶联剂等)，使其表面富含氨基并带正电。修饰后的固相载体表面可利用静电吸附带负电的DNA探针，或通过双功能偶联试剂(如戊二醛)辅助形成共价化学键而连接。 ;3．点样 (1)点样系统：点样系统又叫点样仪或机械手。在直接点样法中，采用的机械手有一套计算机控制的三维移动装置，包括装点样针的点样头、机械手臂、点样针清洗系统、芯片载片台及计算机控制系统。;;点样方式包括接触式点样(针点)和非接触式点样(喷点)。 针点是指用针通过直接接触介质表面将DNA样品点到介质上。 喷点是通过非接触式方式将DNA样品点到介质表面，通常是用加压的方法传递探针 。 ; 针点法;喷点法;2)点样与点样后处理： 通常情况下，点样后处理包括水合、紫外交联、洗脱和封闭4个步骤。 水合的目的是保证样品与基片表面在溶液状态下充分反应。 紫外交联的目的则是让样品与基片表面形成的化学键能够吸收紫外线而变得更加牢固。; 洗脱的目的是为了洗掉那些没有牢固结合的样品，以消除其在杂交过程中的影响。 封闭则是为了消除基片表面活性基团与杂交液中的探针分子之间的非专一性相互作用而产生背景。 ;四、基因芯片的检测方法;2. 样本选择和设计 (1)待测样本的选择：可以是组织来源的或血液来源的，也可以是培养的细胞或病人的体外分泌物等。 (2)对照样本的选择：组织表达谱芯片一般选用正常的相同组织与病例组织作为对照。 ;　基因芯片技术流程 ;（二）检测原理 1. 用于RNA水平的大规模基因表达谱的研究 由于基因芯片在固定介质和标记染料方面的优势，可以实现同一张芯片上多种荧光标记。利用双色荧光系统，可以在一张芯片上实现待测样本和对照样本靶序列的同时检测。 ;