三核酸的琼脂糖凝胶电泳一.PPTVIP

* * 实验三 核酸的琼脂糖凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳的功用 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 二、实验原理： 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、琼脂糖电泳分离DNA的范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 0.15kb 0.2kb 0.6kb 1kb 溴酚蓝 2 1.4 1 0.6 胶浓（%） 1.6kb 2kb 二甲苯青 四、电泳指示剂： 核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 五、影响凝胶电泳的因素 在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。 2、 琼脂糖浓度　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。 3、 DNA分子的构象 　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。 4、 电源电压 　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 5、嵌入染料的存在 　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 6、 离子强度影响 　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 　　 六、材料 前期实验中提取的基因组DNA和质粒DNA，琼脂糖(Agarose) 七、设备 　　水平式电泳装置,电泳仪, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪或凝胶成像系统。 八、 试剂 　　1、 5×TBE电泳缓冲液：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 　　2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液（或30 ％ 甘油），贮存于 4℃。 　　3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 九、操作步骤 1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、 胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60℃，而后到入制胶模具（预先插上样品梳子）中，待胶完全凝固后拨出梳子 ，取出胶块，放入加有0.5×TBE 电泳缓冲液的电泳槽内。 4、 加样：取8μlDNA样品与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。 5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在4