质粒DNA的提取与酶切ppt课件.pptVIP

光学光谱区 远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外 远红外 （真空紫） 10nm~200nm 200nm ~380nm 380nm ~ 780nm 780 nm ~ 2.5 ?m 2.5 ?m ~ 50 ?m 50 ?m ~300 ?m 氢灯 复合光 （阳光及钨灯） 发射光谱 红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 单色光 三棱镜 可见光分光光度计光源 紫外分光光度计光源 光学原理 吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液， 光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收 而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该 溶液的吸收光谱。 苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱 苯(254nm) 甲苯(262nm) A ? 230 250 270 * 紫外分光光度法检测DNA 实 验 三 重组质粒DNA的提取、酶切鉴定及电泳检测 实验安排 上午： 质粒DNA提取 限制性内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶制备 下午： 酶切产物的电泳 紫外分光光度法检测DNA 实验课题设计的要求与安排 1 提取质粒DNA和提取基因组DNA有何不同? 2 限制性内切酶与医学有何关系? 3 可以有哪些技术或方法检测生物样品中的核酸或蛋白质的含量? 问 题 1 设备操作注意点 752型 分光光度计的使用 预热 调零 对照 重复 2) 比色杯的使用 注 意 点 容量 清洁 安全 2 试剂使用注意点 限制性内切酶的使用: 低稳操作; 取量准确; 37 ?C孵育 3 实验课题设计的要求与安排 2-3人一组, 每组ppt报告8-10分钟,老师提问3-5分钟. 第一部分：重组质粒DNA提取 1 实验步骤： 加1.5ml培养物于EP管，12000rpm×30s ? 去上清（除净），加入150μl 溶液I，充分重悬 ? 加入200μl 溶液II，立即、轻柔振荡数次 ? 加入150μl 冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min， 12000rpm×10min 裂解细菌、释放质粒DNA 转移上清到新EP管，加入1/2体积酚加入1/2体积的氯仿：异戊醇 （共约450μl）（酚/氯仿/异戊醇 ----25/24/1） 振荡混匀，离心12000rpm×5min 转移上清到新EP管， 加入等体积氯仿：异戊醇（共约450μl） 振荡混匀，离心12000rpm×5min 除去杂质、纯化质粒DNA 转移上清到新EP管加入2倍体积95%乙醇（约800μl）混匀，静置5分钟以上 离心12000rpm×15min 弃上清， 100 μl 75%乙醇洗沉淀，12000rpm×2min? 弃上清，静置干燥，0.1×TE 20 μl 溶解DNA 酶切鉴定（16 μl） 质粒 (plasmid) 质粒是存在于细菌体内的一类 独立于染色体的自主复制的遗传成分，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 ???? 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子。有一些质粒能携带外源DNA，可以作为目的基因进入受体细胞的运载工具。 ①质粒是细菌内的共生型遗传因子，有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 2 实验原理： 分离纯化质粒DNA 的三个主要步骤： ①培养细菌使质粒扩增 ②细菌的收集与裂解 ③质粒DNA的纯化  所有纯化方法都是利用了质粒DNA分子相对较小及共价闭合环状的性质。 碱法抽提质粒的主要试剂的作用原理 溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl组成. 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒。 EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。 溶液Ⅱ：SDS、NaOH SDS的作用：解聚核蛋白、并与蛋白质结合使之变性； NaOH的作用：破碎细胞，使DNA分子变性。 溶液Ⅲ：KAc、HAc H+中和溶液Ⅱ的OH- K+可与SDS中的Na+发生置换，生成PDS（白色沉淀），与蛋白质和染色体DNA共沉淀 用RNA酶消化除去RNA， 用酚抽提法除去残留的蛋白质。 质粒DNA的进一步纯化： 小分子的质粒DNA呈天然构型，溶解在buffer中。 通过离心可以把沉淀（染色体DNA、蛋白质-PDS复合物等）一起除去。 溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理之后： 质粒的三种构型： 闭合环状DNA 开环DNA——如果两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子因旋转而消除链的张力。 线状DNA——如果两条链均断开，即为