农用土壤颉颃放线菌发酵及其活性产物.pptVIP

农用土壤颉颃放线菌的发酵及其活性产物 与微生物发酵有关的参数 菌体浓度 培养基营养物质的组成 温度 pH 通气量（溶氧） 芽孢杆菌发酵液的活性研究 供试菌：目标菌：苹果炭疽菌(Glomerella cingulata)、柑桔炭疽菌(Colletotrichum gloesporioides Penz)、瓜类炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、棉花炭疽菌(Glomerella gossypii)。 方法 ① 发酵液的制备：将供试菌接入培养液中，30℃下培养48h后离心，回收上清液，15磅压力下灭菌20分钟，置于5℃冰箱中备用。 ② 发酵液与菌悬液抗菌活性比较：（滤纸碟法）取0.1ml炭疽菌的孢子悬浮液均匀涂于PDA平板上，再将分别浸蘸菌悬液和发酵液的灭菌滤纸碟（直径4mm）等距贴于PDA平板上，待炭疽菌菌丝长满培养皿时，测定每纸碟的抑菌圈直径，每处理5个重复。 ③ 发酵液的滴加培养试验：将PDA平板上培养的四种炭疽菌打成直径4mm的菌饼，置于PDA平板上。然后，将发酵液配成原液、1/2、1/4浓度，对照为无菌水。各取50μl点滴于菌丝块上，置30℃温箱中培养72小时后测定菌丝生长直径，各５个重复。 不除菌发酵液的抑菌活性测定 供试菌：三个菌系。目标菌：番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)。 方法 ① 发酵液的制备：将三株供试菌接于NYDA培养液中，30℃下摇床振荡培养48小时后，直接置于5℃冰箱中保存备用。 ② 发酵液处理条件下孢子萌发率的测定：将灰霉菌孢子悬浮液加到上述发酵液中，16小时后测孢子萌发率。对照用NYDA培养液。 抑菌作用的测定 环腐病菌 CMS-1（中国农科院植保所分离，于真空冷冻干燥条件下保存的菌株）。 养基为BPA。 方法 以环腐病菌作为指示菌，利用平板扩散法，进行测定。具体方法是: 在超静工作台上，将约109cfu/ml的环腐病菌悬液0.2 ml加入灭菌培养皿中，然后倒入已冷却至40℃左右的培养基20 ml，充分摇匀，冷却后点上待测菌，放在22℃～25℃温箱中培养3～4d，检查抑菌圈的有、无及大、小情况。 抗生素的分离提取 发酵液的预处理 溶媒萃取法 离子交换法 吸附法 沉淀法 膜过滤技术 现代高压液相色谱技术 3、培养基 放线菌分离培养用培养基:高氏一号培养基 真菌培养及颉抗试验用培养基 ：PDA 液体发酵培养基： 黄豆饼粉20g，玉米粉4g，葡萄糖20g，碳酸钙5g，1000ml 细菌培养基 :牛肉膏蛋白胨培养基 4 、仪器设备 超净工作台 生物显微镜、保湿盒、载玻片、凹玻片、恒温培养箱、 恒温振荡培养箱、微波炉、旋转薄膜蒸发器、真空泵、层析柱、离心机、冰箱、电子天平、PH计、移液枪、磁力搅拌器、旋涡混合器、电热恒温水浴锅、薄层色谱展开缸、高压灭菌锅、鼓风干燥箱。 ZAB-HS和HP-5988A质谱仪、AM-400 NMR核磁共振仪、Nicolet AUATAR 360FT-IR红外光谱仪、岛津UV－240紫外光谱仪、Vario EL元素分析仪、X-4型熔点仪、PE-341 Polarimeter旋光度仪均是由兰州大学化学系实验室提供。 5、试剂 琼脂 葡萄糖 淀粉 糊精 玉米浆 玉米油 黄豆饼粉 蛋白胨 酵母粉 玉米浆 麦麸 K2HPO4 CaCO3 FeSO4?7H2O ZnSO4 CuSO4 (NH4)2SO4 NaCl KNO3 NaOH FeCl3 石油醚 乙醚 三氯甲烷 丙酮 苯 乙醇 甲醇 乙酸乙酯 草酸 乙酸丁脂 茚三酮 品红 双缩脲试剂 邻苯二甲酸－苯胺等 硅胶 D101大孔树脂 732阳离子交换树脂 5 颉抗菌发酵条件的优化 5.1发酵培养基的选择 （1）有机氮源的选择 碳源不变改变氮源的组成 蛋白胨、酵母粉、黄豆饼粉、黄豆饼粉+玉米浆、黄豆饼粉+KNO3、 蛋白胨+玉米浆、酵母粉+NH4SO4、麦麸+酵母粉+黄豆饼粉 （2）有机碳源的选择 氮源不变改变碳源的组成 淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、葡萄糖+糊精、葡萄糖+淀粉、淀粉+蔗糖、 葡萄糖+玉米油 5.1发酵培养基的选择 （4）最优培养基正交实验 (1)发酵培养基起始pH 的选择 PH: 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 (2)发酵时间的选择 24、36、48、60、72、84、96、120小时 (3)发酵温度的选择 26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃ (4)摇床转速的选择 100r