天津大学生物化学05第五章《核酸化学》课件.ppt

（四）RNA的二级结构2(3) （3）位于氨基酸臂对面的反密码环含有组成该tRNA反密码子的三个核苷酸。 反密码子环 反密码子 （四）RNA的二级结构2(4) （4）左臂连接一个二氢尿嘧啶环（D环），环上含有二氢尿嘧啶。 D环 （四）RNA的二级结构2(5) （5）右侧有一个TΨC环（含有T Ψ C顺序，φ代表假尿苷）和一个可变环，不同tRNA的可变环上核苷酸的数目变化较大。 TΨC （四）RNA的二级结构2(5) （6）tRNA分子中含有修饰碱基，但多少不等。在某些位置上的核苷酸对于所有的tRNA都是同样的，或变化很少叫做不变核苷酸。 稀有碱基 （五）RNA的三级结构1 tRNA的三级结构:倒写的L字母 氨基酸的接受端3，-端-CCA 反密码子 （五）RNA的三级结构2 tRNA的三级结构2 第四节 核酸的提取、分离和测定 一、RNA的分离提取 二、DNA的提取和分离 三、核酸含量的测定 一、RNA的分离提取1 目前最常用的为酚提取法：即用缓冲液饱和的酚溶液直接处理组织或细胞，以除去其中的蛋白质和DNA 若加入适量十二烷基硫酸钠或其它去污剂可进一步抑制核糖核酸酶，并使蛋白质去除得更加干净。 将得到的RNA提取液用乙醇反复沉淀数次，溶解后进行透析，再冷冻干燥。 提取不同种类的RNA时，也可将各种亚细胞部分事先分开（因为不同种类的RNA存在于细胞中的不同部位），然后分别从核蛋白体中提取rRNA，从多核蛋白体中提取mRNA，从去除这些成分及其它颗粒后的细胞液中提取tRNA。 一、RNA的分离提取2 1．密度梯度离心法2 2．柱层析法 3．凝胶电泳法 一、RNA的分离提取3(1) 离心管中放30% -- 5%的蔗糖溶液。 欲分离RNA溶液放在蔗糖溶液面上。 经高速离心数小时后，分子大小不同的RNA即分散于不同密度的蔗糖部位中。 应用啡啶溴红—氯化铯密度梯度平衡超离心，可分开不同构象的DNA、RNA和蛋白质。 1．密度梯度离心法1 5％蔗糖 10％蔗糖 20％蔗糖 30％蔗糖 一、RNA的分离提取3(2) 1．密度梯度离心法2 石蜡油 蛋白质 开环形及线性DNA 闭环形质粒DNA RNA 用垂直转头65000转6h，，角转头45000转36h， 离心后，蛋白质在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉淀较快，开链或环形DNA沉淀较慢。 此法分离的DNA纯度较高，可供DNA重组等实验用。如需更纯品，可再进行一次氯化铯密度梯度离心。 一、RNA的分离提取4 2．柱层析法 常用的支持体为二乙胺乙基（DEAE）纤维素（离子交换），葡聚糖凝胶等（凝胶过滤） 因为核酸和核苷酸是两性电解质，在一定的pH值条件下各解离基团的解离情况不同，即有与蛋白质相似的等电点（南大P147）。 一、RNA的分离提取5 3．凝胶电泳法 不同种类的RNA分子所带电荷与其质量之比都非常接近，故用一般电泳方法不易分开。 若以某些凝胶为支持体进行电泳，由于凝胶的分子筛作用可影响不同RNA的泳动速度，则可得到较好的分离效果。 二、DNA的提取和分离 0. 14mol法: 处理方法 结果 浓NaCl溶液（1-2M） 提取组织中的核蛋白 稀释至0. 14mol 后 DNA核蛋白的沉出 RNA核蛋白则不沉出 浓NaCl 溶解DNA核蛋白 氯仿或酚 除去其中的蛋白质 乙醇沉淀 提取溶液中的DNA 蔗糖密度梯度离心法 分开各种DNA CSCl或Cs2SO2浓溶液的密度梯度离心法 分开单股和双股DNA 三、核酸含量的测定1 紫外吸收：嘌呤碱与嘧啶碱有共轭双键，使碱基核苷、核苷酸和核酸在240－290nm紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。 不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫外分光光度计定量及定性测定。 三、核酸含量的测定2 对待测样品是否纯品可用260nm与280nm的OD值，从OD260/280的比值即可判断。纯的DNA的比值应为1.8，纯RNA为2.0，如样品中含杂蛋白，测量比值明显下降。 通常1OD值相当于50μg/ml双螺旋DNA或40μg/ml单螺旋DNA（或RNA）或20μg/ml寡核苷酸计算。不纯的样品可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴红染色可粗略估计其含量。 琼脂糖凝胶电泳图 三、核酸含量的测定2 第五节 核酸的变性、复性与杂交 一、变性 二、复性 三、杂交 四、核酸序列分析 一、DNA的结构1(总） （一）DNA的的碱基组成 （二）DNA的一级结构 （三）DNA的二级结构 （四）DNA的三级结构 （一）DNA的碱基组成 碱基组成的规律： 1．A=T，G=C A+G=C+T 2．没有组织和器官的特异性 3．具有种的特异性 4．年龄、营养状态和环境的改变不影响DNA的碱基组成 （二）DNA的一级结构1 各核