生物化学4抗体制药课件.pptVIP

第四章 抗体制药;4.1 概述 4.2 单克隆抗体 4.3 基因工程抗体 4.4 多功能抗体 4.5 抗体库技术 4.6 抗体诊断试剂 4.7 抗体治疗药物 ;4.1 概述;结晶片段 Fragment crystallizable; 抗体研究的3个阶段： 1、多克隆抗体 含针对多个不同抗原决定簇的不同抗体 不同淋巴细胞产生、针对同一抗原区存在多种抗体 中和外源性毒素（蛇毒、白喉毒素） 非特异性交叉反应不能应用肿瘤和其他疾病治疗。 ;2、单克隆抗体（ monoclonal antibody ，McAb） 仅识别单一抗原决定簇 由同一细胞产生 高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产。 McAb（ monoclonal antibody ）在临床上主要用于诊断和治疗： 疾病的诊断 检测某疾病相关的抗原（ELISA） 治疗 抑制器官移植排斥（抗分化抗原CD3 单抗） 作为药物载体对肿瘤进行定向治疗; McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）： A、鼠源性，产生人抗鼠抗体（HAMA，human antimouse antibody），排斥反应，半衰期短，难维持有效药物作用靶组织时间； B、相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。 需要解决的问题 A、降低McAb的免疫源性 B、降低McAb的相对分子质量; 3、基因工程抗体 人源化抗体（嵌合抗体，chimeric antibody；改形抗体，reshaping antibody；等） 基因工程抗体片断（单链抗体，scFv，single chain antibody；单域抗体VH或VL等） 抗体片断只保留了与抗原特异结合的能力，Fc片断所具有的补体激活、免疫调理等各种生物功能丧失。 ;4.2 单克隆抗体;培养上清中X抗体的检测 克隆化培养;一、抗原与动物免疫 抗原： 种类上无限制（纯化分子、病毒、细菌、细胞等） 纯度无绝对要求（尽可能高纯度抗原） 动物： 骨髓瘤细胞系同品系动物（BALB/c小鼠和Lou大鼠） ; 免疫方法： 体内免疫 皮下、肌肉及腹腔免疫 颗粒性抗原（无需佐剂） 可溶性抗原（加佐剂） 脾内免疫 手术暴露脾脏，直接注入 来源有限、昂贵抗原 免疫效果差 体外免疫 从脾脏或外周血中分离淋巴细胞，加入抗原共培养4~5天。 ;二、 细胞融合与杂交瘤??胞的选择培养 骨髓瘤细胞： 自身不合成或不分泌任何免疫球蛋白分子或片断。 HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶） 融合过程： 取脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107~3*107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 。 HAT选择性培养基培养 ; 动物细胞核苷酸合成两条途径： 全合成途径、补救合成途径 氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻断了阻断GMP、TMP的生物合成。 GMP、TMP的补救合成途径： GMP可以在HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的作用下由次黄嘌呤（hypoxanthine，H）合成。 TMP可以在TK(胸苷激酶)的作用下，由胸腺嘧啶（thymine, T）合成。;A:氨基喋呤 H:次黄嘌呤 T:胸腺嘧啶;三、筛选阳性克隆与克隆化 ;克隆化 克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。 有限稀释法：杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。 软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，培养基为半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。 加入饲养细胞 杂交瘤细胞染色体不稳定，易丢失，反复克隆化，3～4次，至各孔100%抗体阳性;四、 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1、染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中