人脐血内皮祖细胞的分离 培养和鉴定及改良冻融法脱细胞血管支架的建立-isolation, culture and identification of human umbilical cord blood endothelial progenitor cells and establishment of a modified freeze-thaw acellular vascular scaffold.docx

 PAGE 9 人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定及改良冻融法脱细 胞血管支架的建立 中文摘要 血管疾病是目前全球发病率最高的疾病之一，可由动脉粥样硬化、创伤、血 管瘤以及各种先天性异常等因素引起，而主要治疗方法与手段是血管移植术。据 统计，在美国每年欲进行移植血管行动脉旁路术就高达 10 万例以上。因此，如 何进一步扩大血管移植物的有效来源已经成为人们高度关注的重要课题。目前， 血管移植物的临床来源，主要是异体或自体血管以及人工材料，虽然这些材料可 以为诸多的病患进行修复血管提供有利的条件，甚至可以更好地延长病患的生 命，但是远期效果却未达到预期的理想程度。由于异体或是自体血管的移植分别 存有组织相容性比较差，而自体动脉来源也有一定的限制等问题。而人工材料的 应用也存在着一定的问题，小口径(内径小于 6mm)的血管移植过程之中血管存在 着不同程度的高张力、低血流的特殊状态，在病患进行移植之后，其失败率也较 高。与此同时，这些人工血管不具备生长以及自我修复功能。 近年来，随着科学技术的迅速发展与进行，组织工程学以分子生物学、生物 工程学以及细胞生物学、临床医学为基础，通过生命科学与工程学的基本原理和 方法，通过科学、有效的设计、构造、培育以及保养活组织等手段，用以修复或 重建病患的相关组织器官的结构，并成为了维持或改善病患组织器官功能的边缘 科学。而通过利用该项科学技术，有效地将血管种子细胞与相应的支架材料加以 有机结合，则有希望构建出更为理想、有效的组织工程化血管，不但具有较好的 与受体组织相容性、还可以维持管腔的长期通畅率，同时还具有良好的自我修复 能力以及耐久性、可塑性等优势特性。 组织工程血管，通常是利用细胞外基质作为血管支架，充分、有效地运用组 织工程技术，将人工培养的血管内皮细胞种植于血管支架上，再通过相关的技术 手段，使之黏附、分化以及正常生长，同时分泌出 ECM，从而构建出组织相容性 较为良好、无免疫原性、更具较好的持久性与可塑性，且不易钙化、感染、避免 血栓形成的、具有生命力的血管替代物。 Herring[1]等最早地进行了相关人工血管接种血管内皮细胞报道，经过不断 的研究也获得了初步成功。然而，由于构建组织工程血管需极大数量的种子细胞， 就目前来讲，胚胎干细胞、脂肪干细胞髓干细胞等来源的干细胞均存有不同程度 的制约因素，这也促使加强细胞自身的增殖能力，并在较短的时间之内获得更多 的种子细胞的问题，也成为了诸多学者所关注的研究课题。尽管，组织工程种子 细胞目前主要来自血管壁细胞、内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞以及胚胎干细胞， 而内皮祖细胞却具有更多的优点，从而被诸多学者认为内皮祖细胞是构建组织工 程血管过程中的最佳种子细胞来源。 而支架材料的研究是组织工程血管的另一重要组成部分。组织工程血管要求 支架必须具有良好的生物相容性、生物降解性，可以保持完整的三维立体结构， 具有一定的机械强度和血管弹性。并且在植入体内后，不与机体发生免疫排斥反 应。 本文就种子细胞的来源及自体血管支架的建立进行相关研究。旨在进一步探 讨和简化内皮祖细胞的来源，为种子细胞的大量获取提供更多方法。而自体脱细 胞血管支架的建立，为血管支架的来源提供了又一新的可能性，为血管组织工程 应用于临床提供了新的思路和方法。 第一部分 人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定 研究目的： 从婴儿新鲜脐带血中进行内皮祖细胞的分离，并对其进行科学的培养与鉴 定。本文采用 6%羟乙基淀粉沉降法和 percoll 非连续性密度梯度离心法，在新 鲜人脐血中进行内皮祖细胞（EPCs）分离，并将分离出的细胞纯化，在体外进行 进一步的培养和增殖。采用相关抗原免疫染色对所培养的人脐血内皮祖细胞进行 鉴定。以进一步探寻简化的实验步骤，如何获得足量内皮祖细胞的最佳实验方法， 并为实验课题提供充足、健康的内皮祖细胞来源，为下一步实验准备充足的细胞 来源。同时，深入探讨人脐血中分离并大量培养内皮祖细胞的可行性以及临床应 用价值。 研究方法： 收集蚌埠医学院第一附属医院妇产科足月剖腹产手术胎儿脐带血，无菌条件 下放置于含有 50U/ml 肝素的血清瓶中，放置于 4°C 冰盒中保存，运送至细胞培 养室，采用密度梯度离心法来获取脐带血单个核细胞，将获取的单个核细胞分成 两份，加入胎牛血清 M199 培养基（FCS-M199）及自体血清 M199 培养基（AS-M199）， 并分别将其接种于铺设有人纤维连接蛋白（HFN）和未铺设有人纤维连接蛋白的 培养皿中（标记为：F(0)、F(1)、A(0)、A(1)）进一步进行体外诱导、分化以及 扩增。并观察贴壁细胞在整个诱导分化过程中的形态学变化，结合免疫组化、免 疫荧光以及流式细胞仪等相关技术从不同角度对其进行鉴定。 研究结果： （1）培养