体外构建一种新型可注射组织工程髓核的初步实验分析-preliminary experimental analysis of constructing a new injectable tissue engineering nucleus pulposus in vitro.docx

II II 体外构建一种新型可注射组织工程髓核的初步实验研究 中文摘要 【目的】 1.通过观察富含血小板血浆（Platelet-rich plasma,PRP）凝胶的超微结构，探讨其生物 学特性及作为支架材料构建可注射组织工程髓核的可行性。2.探讨以自体富含血小板血浆 （PRP）凝胶支架复合兔脂肪间充质干细胞（ADSCs）构建可注射组织工程髓核的可行性。 【方法】 1. 采用二次离心法制备 PRP 凝胶 20 例，分别采用全自动血细胞分析仪对全血和 PRP 行 PLT 计数并用酶联免疫吸附法测定全血和 PRP 凝胶中 TGF-β1 及 PDGF-AB 的浓度；同 时，对 PRP 凝胶行大体观察、HE 染色、透射及扫描电镜观察。2.将体外扩增的第 3 代兔脂 肪间充质干细胞经流式细胞仪鉴定后接种至富含血小板血浆凝胶支架中体外立体培养。2 周、4 周、8 周时分别行大体观察，组织学染色及蛋白多糖定量检测；BrdU（5-溴-2-脱 氧尿嘧啶）免疫荧光法观察细胞在 PRP 支架中的存活情况；实时荧光定量 PCR 法检测 HIF-1α、蛋白多糖、ColⅡ基因表达情况。 【结果】 1.PRP 中的血小板（PLT）数量达到全血的 4.58 倍左右；PRP 凝胶中含有高浓度的 TGF-β1，PDGF-AB；扫描电镜及透射电镜观察均显示 PRP 凝胶主要由大量纤维蛋白网和 血小板构成。2.流式细胞仪检测显示脂肪干细胞表面标记物 CD90，CD105 的阳性率分别 为 95.2%和 97.4%，而 CD45，CD34 的阳性率分别为 0.9%和 1.4%。番红 O 染色及糖胺聚 糖定量检测显示细胞具有分泌 ECM 的功能，并提示培养 4 周时糖胺聚糖含量较培养 2 周 时明显增高（P0.05），8 周时较 4 周时明显增高（P0.05）；HE 染色和扫描电镜可见细 胞均匀分布于网络状支架表面；BrdU 免疫荧光法显示细胞在支架中生存状态良好，8 周 时仍可见多数活细胞；复合体培养 4 周时与培养 2 周时比较 3 个目的基因 mRNA 表达量 均增高，有显著性差异（P0.05），8 周时与 4 周时比较亦明显增高（P0.05）。 【结论】 富含血小板血浆凝胶（PRP）具有良好的组织工程支架材料特性，富含血小板血浆凝 胶支架与脂肪干细胞共培养后，可诱导脂肪干细胞向类髓核样细胞分化，提示富含血小板 血浆凝胶可能是构建可注射组织工程髓核较为理想的一种支架材料。 【关键词】 富含血小板血浆凝胶；脂肪间充质干细胞；组织工程；髓核：兔 III III Construction Of A New Style Injectable Tissue Engineered Nucleus Pulposus In Vitro ABSTRACT Objectives:1. To observe microstructure and ultrastructure of Platelet-rich plasma gel,and to investigate its potential biological characteristics and the possibility of it used as a injectable scaffold material for tissue engineering nucleus pulposus.2. To explore the feasibility of platelet-rich plasma gel as scaffold and adipose derived stromal cells as seed cells construction of injectable tissue engineering nucleus pulposus in vitro. Methods:1. Twenty-five PRP gel samples were obtained by two-step centrifugation method. Before and after centrifugal platelet cells in the whole blood and PRP were determined by Automatic Blood Cell Analyzer. TGF-β1,PDGF-AB in the PRP gel and the whole blood were measured using the enzyme-linked immunosorbent assay method. and then PRP gel samples were observed by macroscopic observa