五味子活性成分的筛选及其对心肌缺血再灌注的保护作用-screening of active components from schisandra chinensis and its protective effect on myocardial ischemia-reperfusion.docx

山西医科 山西医科大学硕士学位论文 5.3 实验结果45 5.4 讨论 46 参考文献 47 综述 南北五味子木脂素类有效成分及药理作用研究 51 攻读学位期间发表文章情况 57 致 谢 58 个人简历 59 I I 摘 要 目的：南五味子（SSF）和北五味子（SCF）在传统中医中常作为滋补药使用， 近年研究表明五味子具有保护心肌的作用，但是具体的药效成分不明。本课题建立心 肌细胞膜-液质联用的分析方法对南北五味子的活性成分进行了筛选，并系统观察了活 性成分对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用。 方 法 ： 首 先 建 立 心 肌 细 胞 膜 色 谱 - 液 质 离 线 联 用 的 分 析 方 法 （CM/CMC-Offline-LC/MS），并用此方法筛选、鉴定南北五味子提取物中的活性成 分。此方法是采用大鼠心室肌细胞制备心肌细胞膜（CM/CMC）色谱柱的固定相；采 用阳性药物对照品尼群地平（NT）、硝苯地平（NF）和阴性药物对照品格列齐特（GC）、 格列美脲（GM）考察 CM/CMC-Offline-LC/MS 方法的适用性和可靠性；将 SCF 和 SSF 提取物分别进入 CM/CMC 色谱系统进行分离、筛选；收集 CM/CMC 上的保留组分， 在优化条件下进入液质（LC/MS）系统进行分析、鉴定活性成分。 其次，通过超声分散-高压纳米机法分别制备五味子甲素（DSD）、五味子酯甲 （STA）静脉注射亚微乳剂，该乳剂以大豆卵磷脂为乳化剂、注射用油为油相。并采 用高效液相色谱法测定了 DSD 和 STA 的含量。 最后，构建大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，系统观察了 DSD 和 STA 对大鼠心肌 缺血/再灌注损伤的保护作用。实验中以雄性 Wistar 大鼠经可逆性结扎左冠状动脉前 降支建立在体心肌缺血/再灌注损伤模型，分别尾静脉注入 DSD 和 STA 乳剂，通过测 定心功能、心肌梗塞面积、生化指标、组织病理学、心肌细胞凋亡以及心肌中 caspase-3 蛋白、gp91phoxmRNA 表达的变化；分离新生大鼠心肌细胞，DSD 或 STA 预处理后再 以 H2O2 损伤，用流式细胞术测定细胞的凋亡情况，考察 DSD 和 STA 对大鼠心肌缺血 /再灌注损伤的保护作用。 结果：通过 CM/CMC-Offline-LC/MS 方法从 SSF、SCF 中筛选出的活性成分 DSD 和 STA 可以与心肌细胞膜结合，提示其可能具有保护心肌的作用。课题所制得的静 脉注射亚微乳剂含量稳定，且克服了 DSD 和 STA 溶解度差的问题。 药理实验结果表明：(i) DSD 和 STA 可明显减轻缺血/再灌注后 LVSP、LVEDP、± I II dp/dtmax 和心律失常指标的异常变化，显示有改善心功能效应；(ii) DSD 和 STA 能减 小心肌梗塞面积，降低 MDA 的释放，增加 SOD 活力，显示有减轻心肌损伤的效应； (iii) 3. 组织形态学观察和心肌纹理分析也表明 DSD 和 STA 有减轻心肌组织病理损害 的作用；(iv) 与缺血再灌注组比较，DSD 和 STA 可显著减少心肌细胞凋亡（由缺血/ 再灌注组的 33.56 ± 2.58%减少为 10.28 ± 2.80%和 10.98 ± 1.99%），并降低 caspase-3 的活性（由缺血/再灌注组的 0.62 ± 0.02 OD/mg 减少为 0.38 ± 0.02 OD/mg 和 0.32 ± 0.02 OD/mg），提示 DSD 和 STA 可能具有保护心肌细胞的效应；(v) 研究结果表明 DSD、 STA 和阳性对照药美托洛尔可以改善心肌缺血/再灌注损伤，并且作用相似。(vi) 体外 研究表明，DSD 或 STA 可以明显降低 H2O2 引起的新生大鼠心肌细胞凋亡。 结论：研究结果表明，所建立的 CM/CMC-Offline-LC/MS 分析方法筛选得到的 DSD 和 STA 可以明显减轻由缺血/再灌注引起的心肌损伤，并初步阐明其保护机理可 能与抑制心肌细胞凋亡有关。本研究提示 DSD 和 STA 对治疗缺血性心脏疾患具有潜 在的临床应用价值。 关键词：五味子甲素；五味子酯甲；心肌缺血/再灌注；心肌梗死面积；凋亡 PAGE PAGE III The selection of bioactive compounds in Fructus Schisandrae Chinensis and Fructus Schisandrae Sphenantherae and its Effects on the Myocardial Ischemia / Reperfusion Abstract Background: S