绿色荧光蛋白balbc裸小鼠品系建立及在胶质瘤干细胞诱导宿主肿瘤间质细胞恶性转化中的研究-establishment of green fluorescent protein bal bc nude mouse strain and its application in malignant transformation of host tumor interstitial cells induced by glioma stem cells.docx

绿色荧光蛋白 Ba 绿色荧光蛋白 Balb/c 裸小鼠品系建立及在胶质瘤干细胞诱导宿主肿瘤间质细胞恶性转化中的研究 中文摘要 中文摘要绿色荧光蛋白 B 中文摘要 绿色荧光蛋白 Balb/c 裸小鼠品系建立及在胶质瘤干细胞诱导宿主肿瘤间质细胞恶性转化中的研究 I I PAGE PAGE IV 绿色荧光蛋白 Balb/c 裸小鼠品系建立及在胶质瘤干细胞 诱导宿主肿瘤间质细胞恶性转化中的研究 中文摘要 第一部分：绿色荧光蛋白 Balb/c 裸小鼠品系建立及 EGFP/RFP 双色 荧光示踪胶质瘤原位移植模型的制备 目的：培育表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的近交系裸小鼠，用于接种 转红色荧光蛋白(RFP)基因的胶质瘤细胞，建立 RFP/GFP 双色荧光示踪的肿瘤模型， 用于肿瘤微环境中肿瘤-宿主相互作用研究。 方法：（1）将转 EGFP 基因的 C57BL/6♀与 Balb/c（nu/nu）♂杂交，在 F1 代中 通过 PCR 挑选 nu/+ EGFP♀与 Balb/c（nu/nu）♂回交，或者与同窝 nu/+ EGFP♂近交， 据此标准，按传统近交规则进行连续回交传代至 F10 后按封闭群管理；（2）将载有 红色荧光蛋白（DsRFP）基因的慢病毒转染到 SU3、U87-MG，以 CM-DiI 染 C6 胶质 瘤细胞；（3）将 1X105 的上述 3 株细胞分别在立体定向仪辅助下，注入 EGFP 裸小 鼠右尾状核，实验结束取全脑做荧光细胞检测。 结果：（1）培育成功的 EGFP 裸小鼠中 nu/+ EGFP 与 nu/nu EGFP 各占 50%,全 身(毛和红细胞除外)表达 EGFP；（2）SU3，U87 荧光基因转染和 C6 荧光染色成功 的细胞比例接近 100％；(3)RFP/GFP 移植瘤组织，在荧光或激光共聚焦显微镜下，见 到 RFP+ 细胞在脑实质，脑室壁，脑血管旁等所到之处均能生长，部分细胞与 GFP+ 细 胞发生交织或融合。 结论：培育成功的近交系 EGFP+ Balb/c 裸小鼠适合转 RFP 基因的人癌细胞移植 实验，建成的 RFP/GFP 实体瘤对研究肿瘤组织重构中肿瘤细胞与宿主细胞间相互作 用有重要价值。 关键词：荧光裸小鼠；双色荧光示踪实体瘤模型；肿瘤组织重构；肿瘤微环境 第二部分：胶质瘤干细胞异种移植瘤宿主间质细胞恶性转化 目的：用转红色荧光蛋白(RFP)基因的胶质瘤干细胞移植自建的表达增强型绿色 荧光蛋白（EGFP）基因的近交系裸小鼠，建立 RFP/EGFP 双色荧光示踪的肿瘤模型， 研究肿瘤组织重构过程中宿主来源肿瘤间质细胞的恶性转化并初步探讨可能的机制。 方法：将已建株的人脑胶质瘤干细胞 SU3 转染红色荧光蛋白基因（RFP）后得到 SU3-RFP，体内将其接种于 EGFP 裸小鼠皮下、腹腔和颅内，体外则以 SU3-RFP 与 EGFP 裸小鼠的腹腔灌洗细胞（PLC）或骨髓来源细胞（BMDC）直接共培养，SU3-RFP 与胎鼠成纤维细胞（MEF）在 Transwell 小室间接共培养和直接混合共培养。体内移 植瘤组织再培养和体外共培养的混合细胞群分别用流式细胞仪分选 EGFP 阳性和 EGFP/RFP 双阳性细胞群，并用单细胞克隆技术克隆永生化的表达 EGFP 的肿瘤间质 细胞和共表达 EGFP/RFP 细胞，进一步分析这些细胞体外生长特性如克隆形成率、迁 移运动性和侵袭能力以及在 Balb/c 无胸腺裸小鼠的致瘤情况，RT-PCR 检测了部分癌 基因和标记物的转录水平；免疫组化对细胞的可能来源进行初步鉴定。在活细胞工作 站下观察 SU3-RFP 和 PLC 共培养，实时动态观察肿瘤宿主相互作用关系。 结 果 ： SU3-RFP 干 细 胞 在 EGFP 裸 小 鼠 的 皮 下 , 腹 腔 和 颅 内 致 瘤 率 均 为 100%(15/15)，体内移植瘤和体外共培养的体系中通过激光共聚焦显微镜和流式细胞 仪检测均发现有 RFP+,EGFP+和 EGFP/RFP 双阳性的三种类型的细胞存在，流式分选 及克隆后得到 EGFP+和 EGFP+/RFP+的克隆细胞群，进一步 RT-PCR 和免疫组织化 学证明 EGFP+细胞表达成纤维细胞标记α-SMA，FAP 和 S100A4，而且表达骨髓间 充质细胞标记物 CD105；EGFP/RFP 双阳性细胞不仅表达胶质瘤干细胞 SU3-RFP 的 标记物 Nestin，而且表达骨髓间充质细胞标记物 CD105，CD29 等，而且这些细胞 （ 1×105 个 / 只 ） 在 无 胸 腺 裸 小 鼠 的 致 瘤 率 100% （ 15/15 ） ， RT-PCR 检 测 显 示 P53,bcl-2,Ccnd1,Ras,MMP9 等的转录水平明显高于正常对