人类冠状病毒hku1非结构蛋白9功能性突变体n60k的晶体学研究-crystallographic study of functional mutant n60k of human coronavirus hku 1 nonstructural protein 9.docxVIP

万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 陈侠 2015 年 05 月 14 日 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目申请密级□限制(≤2 年)□秘密(≤10 年)□机密(≤20 年)保密期限20 年月日至 20 年月 日审批表编号批准日期 20年 月 日南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 摘要 摘要 人类冠状病毒 HKU1 属于冠状病毒亚科 β 属 A 组群冠状病毒，主要引起人 类自限性上下呼吸道感染, 在免疫系统受损或低下的人群中情况更为严重，特 别是哮喘病人和新生儿童。冠状病毒基因组编码复制酶蛋白基因、结构蛋白基 因和附属蛋白基因。复制酶多蛋白被主蛋白酶和附属蛋白酶切割成 16 个非结构 蛋白，进而组装成复制、转录复合体，介导病毒传播。非结构蛋白 9（nsp9） 是一种 DNA/RNA 结合蛋白，在病毒复制转录过程中起着至关重要的作用。β 属冠状病毒基因组 3‘非翻译区（UTR）存在两个保守性的二级结构——凸出茎 环和假结。在研究小鼠肝炎病毒基因组 3‘非翻译区的过程中发现假结处 6 个碱 基（AACAAG）的插入会造成病毒几近死亡，病毒传代实验中发现一个病毒回 复突变体 U13017G（nsp9 N60K）能救活病毒，但是其挽救病毒的机制未知。 小鼠肝炎病毒 nsp9 蛋白结构尚未被解析，但 N60 在 β 属冠状病毒 nsp9 蛋白一 级序列中是相对保守的。因此，选择人类冠状病毒 HKU1 nsp9 为模型，研究 nsp9 与病毒基因组 3’UTR 的相互作用机制。 此篇论文以人类冠状病毒 HKU1 非结构蛋白 9 为研究对象，构建 N60K 克 隆，通过一系列表达纯化手段，获得了纯度较高的 HCoV-HKU1 nsp9 N60K 蛋 白。经过反复的结晶尝试晶体，获得衍射分辨率高达 2.6 埃的蛋白晶体。 关键词：冠状病毒；HKU1；非结构蛋白 9；N60K；功能性突变 I Abstract Abstract Human coronavirus HKU1 belongs to group A of the β coronavirus, which is responsible for acute self-limited respiratory tract infections. It could cause more severe syndromes in patients with a compromised or impaired immune system, especially pasthma sufferers or newborn infants. Non-structural proteins (nsp1–16), which are encoded by coronavirus genomes, could assemble into a large replication–transcription complex mediating virus replication. Overlapping bulged stem-loops and pseudoknots are situated in the upstream 3‘UTRs of all β coronavirus. Nonstructural protein 9 has been shown to be indispensible for viral replication. It can bind to the single-stranded DNA/RNA. Interestingly, an insertion mutation of six nucleotides (AACAAG) in the pseudoknot is lethal for the mouse hepatitis virus. It has been shown that a functional