小鼠骨髓间充质干细胞sca-1cd45cd31亚群向心肌样细胞分化机制的实验研究-experimental study on differentiation mechanism of mouse bone marrow mesenchymal stem cells sca - 1 cd 45 cd 31 subgroup to cardiomyocyte-like cells.docx

小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+CD45+CD31+亚群向心肌样细胞分化机制的实验研究中文摘要第一部分促心肌分化基因筛选目的：对SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四个亚群基因芯片结果通过Real-timePCR筛选出在SCA-1+CD45+CD31+亚群表达最高的基因方法：根据基因芯片结果筛选出在SCA-1+CD45+CD31+亚群表达量最高的基因，包括myl3、Itga4、Epor、Rock2、Cxadr、设计引物。提取SCA-1+CD45+CD31+、SCA-1+CD45+CD31-、SCA-1+CD45-CD31+、SCA-1+CD45-CD31-四组亚群细胞及未分选群细胞的RNA，逆转录成cDNA，进行Real-timePCR检测各基因在四组亚群及未分选群细胞中的表达量。结果：经Real-timePCR检测，Itga4在未分选组中表达最高、Epor在SCA-1+CD45-CD31+亚群中表达最高、Rock2在SCA-1+CD45-CD31-亚群中表达最高、Cxadr在SCA-1+CD45-CD31-亚群中表达最高，myl3在SCA-1+CD45+CD31+亚群中表达最高，且与其他亚群及未分选群比较有统计学差异（P0.05）。结论：myl3在SCA-1+CD45+CD31+亚群中表达量明显高于其他三个亚群及未分选群。myl3为肌球蛋白轻链家族中一员，是肌小节粗肌丝的组成部分，属于碱性轻链慢肌/心室肌型，目前研究表明其在肌肉再生，促进肌肉收缩方面有重要作用，而目前尚未有研究其在促进心肌分化方面的作用。第二部分小鼠心梗模型的建立目的：开胸直视下结扎小鼠冠状动脉前降支，成功建立小鼠心肌梗死模型，进行体内实验。方法：24只雄性C57BL/6小鼠，体重在14-22g，分为心梗组（n=12），假开胸组（n=12），常规麻醉，固定小鼠，气管切开插管，开胸，找到前降支，结扎，心梗建立成功，逐层关胸后拔气管插管。比较结扎前后心电图，心超及组织学变化。结果：结扎后心电图导联ST段明显抬高，0.2mv，术后四周心超提示心梗组EF和FS值较假开胸组明显下降（P0.05）,左室舒张末期内径和左室收缩末期内径明显增加（P0.05），心脏HE染色证实建模成功。结论：气管插管开胸直视下行小鼠冠状动脉前降支结扎术成功建立小鼠心梗模型。第三部分myl3促进小鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的体外研究第一节小鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定目的：从小鼠骨髓中分离出有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymalStemCells，BMSCs)。为进一步的实验研究提供可靠的细胞。方法：小鼠全骨髓培养。流式鉴定细胞表面抗原表达。结果：体外培养的原代MSCs10～14d达到融合，结果显示超过90％小鼠骨髓间充质干细胞性表达CD29（细胞整合素分子）、CD90（粘附分子）和CD44（粘附分子，介导细胞对透明质酸和骨桥蛋白的粘附）；但不表达造血祖细胞表面标志CD11b、CD133。结论：利用MSCs贴壁特性，在体外条件下成功分离、培养和扩增了小鼠骨髓间充质干细胞，用于下面体内体外研究。第二节转染myl3-siRNA检测心肌特异性因子表达目的：将合成的myl3-siRNA转染进小鼠骨髓间充质干细胞，并检测转染后的心肌特异性因子的表达。方法：利用lipofactaminTM2000转染试剂将合成好的myl3-siRNA转染进小鼠骨髓间充质干细胞作为实验组（A组），另将空白载体的siRNA转进小鼠骨髓间充质干细胞作为对照组（B组），24h倒置荧光显微镜下观察GFP表达检测转染效率。并用心肌细胞裂解液诱导A组和B组向心肌样细胞分化。48小时后收集细胞，设计myl3引物，Real-timePCR检测其表达量。设计GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin引物，Real-timePCR检测心肌特异性因子在转染后的表达。结果：转染效率达60%以上。Real-timePCR检测myl3表达量较对照组明显下降。进一步检测心肌特异性因子GATA-4、Cx43、Nkx2.5、cTnT、a-actin，与对照组比均下降。结论：成功构建myl3-siRNA，转染骨髓间充质干细胞后能下调心肌特异性因子。第三节构建过表达myl3质粒目的：构建myl3过表达质粒，并对构建好的质粒进行测序鉴定。方法：从含有目的基因的质粒克隆模板中，利用PCR方法钓取目的基因，若没有模板则利用全基因合成的方法得到目的基因。将目的基因与目的载体分别进行酶切。纯化酶切产物后进行连接，将连接产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行酶切鉴定，证明目的基因已经定向连入目的载体。再对阳性克隆