细胞内多种活性小分子gsh cys hcy,no ca2同时定量检测的新方法研究-study on a new method for simultaneous quantitative determination of gsh cys hcy and no ca2 in cells.docxVIP

目录摘要IABSTRACTIII主要符号与缩写VI第一章NPSP同位素探针的合成及其用于正常与癌症细胞内多种小分子生物硫醇的质谱定量分析11引言11.1正常与癌变细胞中多种小分子生物硫醇研究的意义31.1.1细胞的氧化还原状态与疾病的关联31.1.2生物硫醇在细胞抗氧化系统中的重要作用31.2小分子生物硫醇的检测方法51.2.1目前小分子生物硫醇检测方法及其局限性51.2.2同位素标记质谱定量分析法51.3小分子生物硫醇检测存在的困难131.3.1小分子生物硫醇易氧化131.3.2常用的生物硫醇衍生化试剂存在的不足131.3.3NPSP探针衍生化生物硫醇中的优势141.4本章的研究内容142.实验部分162.1试剂与仪器162.2试剂处理17NPSP-d5的合成17NPSP-d5的合成路线17NPSP-d5的合成步骤182.4生物硫醇的衍生化标记192.5细胞培养与预处理202.6细胞悬浮液细胞密度调节202.7细胞中生物硫醇的衍生化标记21i山东师范大学硕士学位论文2.10.1色谱条件222.10.2质谱条件233结果与讨论233.1NPSP同位素探针与生物硫醇的反应机理233.1.1NPSP同位素探针与生物硫醇的反应比例243.1.2NPSP同位素探针与生物硫醇的反应时间243.2NPSP同位素探针与生物硫醇的反应253.3NPSP同位素探针避免生物硫醇的氧化293.4NPSP同位素探针对生物硫醇的相对定量323.5探针毒性实验323.6Biothiols-NPSP的稳定性353.7L02及HepG2中多种小分子生物硫醇的相对定量检测363.7.1LC/ESI-MS检测多种小分子生物硫醇方法的建立363.7.2细胞中多种小分子生物硫醇的定量分析374本章总结405参考文献40第二章微流控芯片电泳-激光诱导荧光法同时定量检测单细胞内NO与Ca2+的研究511引言511.1NO与Ca2+的生理作用及研究的意义511.1.1NO的生理作用及研究的意义511.1.2Ca2+的生理作用及研究的意义521.1.3NO与Ca2+的相互关联531.2现有NO与Ca2+检测的方法及不足541.2.1NO的检测541.2.2Ca2+的检测54ii1.2.3NO与Ca2+的同时检测541.3基于微流控的单细胞组分分析的研究进展551.3.1单细胞分析的重要意义551.3.2微流控单细胞分析551.4本章研究内容602NO与Ca2+荧光探针的选择603实验部分623.1试剂与仪器623.2微流控芯片-激光诱导荧光检测系统633.3细胞的培养643.4样品的制备653.4.1NO标准液的制备653.4.2NO荧光产物DAF-FMT标准溶液的制备653.4.3Ca2+荧光产物Fluo-3T标准溶液的制备653.5微芯片的预处理及基线稳定性考察663.6单细胞的连续操纵673.7单细胞内NO和Ca2+的同时定量检测684结果与讨论694.1探针DAF-FMDA和Fluo-3AM的反应机理及荧光光谱表征694.2方法的性能704.2.1分离性能704.2.2线性范围、检出限、及重现性714.3单细胞内NO和Ca2+的同时定量检测735本章总结736参考文献73附录谱图81致谢86iii摘要细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单位，是生命科学研究的根本出发点。细胞内源性小分子，如小分子硫醇（GSH、Cys、Hcy）、一氧化氮（NO）、钙离子（Ca2+）等，是生命活动过程中重要的活性小分子。这些活性小分子不仅参与细胞活化、调控等重要的生理过程，而且与疾病的发生、发展密切相关。其中，GSH不仅维持着生物体的氧化还原平衡，而且参与细胞凋亡等过程的信号传导，同时能够解除外源化合物的毒性;Cys和Hcy的生理浓度水平也是重要的健康指标,Cys缺乏与儿童生长缓慢、造血功能减弱、嗜睡和肝脏损伤等病症相关，而Hcy浓度升高则是心血管疾病、动脉粥样硬化、老年痴呆症等疾病的风险因子。NO作为重要的信号分子，在神经系统、心血管系统、及免疫系统中具有重要的调节作用，且NO含量异常与心血管疾病（高血压、冠心病、心肌梗死、心绞痛等）、糖尿病、癌症等疾病相关。Ca2+作为重要的第二信使，几乎参与所有的生理调控，而且一些疾病的发生和发展都伴随着细胞内Ca2+分布和浓度的大幅度变化。另一方面，活性小分子在细胞中不仅共存，而且反应活性高、彼此相关、相互协同，相应检测技术应具备高灵敏度、高选择性以及有效分离性能。为揭示它们在细胞功能调控中的作用以及与疾病关联，必须了解细胞内该类物质的定量信息、以及它们之间相互作用的真实信息，因此迫切需要发展高灵敏、多参数、可同时定量测定细胞内多种活性小分子（GSH、Cys、Hcy，NO、Ca2+）的新方法。本论文主要包括以下两个部分：第一章，鉴于细胞内小分子生