腺病毒介导timp-4基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响-effect of adenovirus-mediated timp - 4 gene transfection on biological behavior of vascular smooth muscle cells.docx

腺病毒介导 腺病毒介导 TIMP-4 基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响 第三军医大学博士学位论文 第三军医大学博士学位论文 IV IV V V 腺病毒介导 TIMP-4 基因转染对血管平滑肌细胞 生物学行为的影响 摘 要 背景和目的 血管新生内膜形成是 PTCA 和支架术后 RS 的病理基础 VSMC 的 迁移则是新生内膜形成的关键步骤 必须首先突破 ECM 的束缚方能穿过内弹力膜发 生迁移形成新生内膜 ECM 的稳定是维持血管壁完整性的重要基础 MMPs 及其组织 抑制因子 TIMPs 是维持 ECM 稳态最重要的蛋白酶家族 血管损伤后 受损血管局部 的 VSMC 在各种细胞因子的刺激下发生细胞表型的改变 由收缩型转变为合成型 分 泌大量的 MMPs 打破了维持 ECM 稳态的 MMPs/TIMPs 动态平衡 分泌到胞外的 MMPs 使 ECM 蛋白发生降解 从而解除了 ECM 对 VSMC 的束缚 打通了 VSMC 迁 移的道路 因此 MMPs 可能在新生内膜形成过程中扮演了分子开关的角色 由此可 见 维持 MMPs 与 TIMPs 之间的动态平衡是十分重要的 近年来的一些研究证实 血 管损伤时局部过表达 TIMP-l TIMP-2 和 TIMP-3 均可明显减少 VSMC 迁移 抑制新 生内膜增生 TIMP-4 作为 TIMPs 家族的新成员 表达具有心脏特异性 目前关于 TIMP-4 生物学功能的研究报道较少 是否也会对 VSMC 的迁移与增殖产生影响 尚 未见报道 本实验构建了携带 TIMP-4 基因的重组腺病毒载体 通过转染体外培养的大 鼠 VSMC 研究增强其表达对 VSMC 增殖 迁移等生物学行为的影响 以进一步明确 TIMP-4 的生物学活性 为 TIMP-4 在 RS 防治研究中的应用提供理论依据和实验证据 方法 采用位置特异性重组方法构建携带人 TIMP-4 基因表达序列的复制缺陷 型 5 型腺病毒载体 经 293 细胞扩增 纯化制备高滴度病毒转染液 将获赠的对照病 毒 Ad.LacZ 以相同方法进行扩增和纯化 采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉 VSMC 以形态学和免疫细胞化学鉴定 以病毒转染液常规转染 VSMC 后 应用 RT-PCR 免疫细胞化学和蛋白免疫印迹等方法分别检测 TIMP-4 基因在 VSMC 转录和 翻译水平的表达 以酶谱法zymography和逆向酶谱法reverse zymography检 测 VSMC 表达分泌的 TIMP-4 的蛋白活性 应用带 Matrigel 基底膜基质的 Millicell 培养小室研究 TIMP-4 表达对 VSMC 迁移的影响 应用四唑盐 MTT 比色实验 3H 标记的胸腺嘧啶核苷 3H-TdR 掺入实验 流式细胞仪等检测 TIMP-4 表达对 VSMC 增殖的影响 结果 应用 DNA 重组技术 成功构建了携带 TIMP-4 基因的重组穿梭质粒载体 pDC315.TIMP-4 将其与腺病毒基因组质粒 pBHGloxE1,3cre 在脂质体介导下共转染 293 细胞 通过位置特异性重组 经 PCR 法筛选 鉴定 成功获得了携带 TIMP-4 基因的 人类 5 型复制缺陷型腺病毒 Ad.TIMP-4 构建的 Ad.TIMP-4 通过大量复制和纯化 获 10 得滴度约 5 10 pfu/ml 对照病毒 Ad.LacZ 经扩增 纯化 获得滴度为 7.5×1010pfu/ml Ad.TIMP-4 和 Ad.LacZ 的最佳转染复数均为 100MOI 采用组织块贴壁法原代培养 大鼠主动脉 VSMC 经形态学和免疫细胞化学鉴定证实为 VSMC 6 8 代时 VSMC 纯度几近 100% 通过 RT-PCR 免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹等方法表明 正常 培养的 VSMC 不表达 TIMP-4 Ad.TIMP-4 转染 VSMC 后检测 TIMP-4 细胞表达率 mRNA 和蛋白表达的结果均证明 VSMC 成功表达了 TIMP-4 表达率随转染时间延长 逐渐增加 转染后 2d 可达 86.5% 高水平的表达可维持 6d 以上 酶谱法和逆向酶 谱法结果证明 Ad.TIMP-4 转染 VSMC 后表达分泌的 TIMP-4 具有抑制 MMPs 的生物学 活性 在实验过程中对检测 TIMP-4 生物学活性的酶谱法和逆向酶谱法进行了优化 Ad.TIMP-4 转染 VSMC 后 TIMP-4 表达可显著抑制 PDGF 趋化作用引起的 VSMC 迁移 并且随转染时间的延长 TIMP-4 表达增多 迁移的 VSMC 数呈更加减少的趋 势 与 Ad.LacZ 组相比 VSMC 迁移数最大减少 78.7 Ad.TIMP-4