文蛤meretrix meretrix壳色花纹性状的分子遗传基础分析-molecular genetic basis analysis of shell color pattern traits of meretrix meretrix meretrix.docxVIP

宁波大 宁波大学硕士学位论文 文蛤（ 文蛤（Meretrix meretrix）壳色花纹性状的分子遗传基础研究 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据 文蛤(Meretrix meretrix)壳色花纹性状的分子遗传基础研究 摘 要 文蛤（Meretrix.meretrix）是我国沿海水产养殖的重要经济贝类，其丰富多彩的壳色 花纹可以遗传给后代，并且与生长、抗逆等经济性状密切相关，一些色泽鲜艳的文蛤商 业价值显著提高。许多水生动物体色、壳色多态性的产生是由于体内控制色素合成的基 因发生变异，而且红、黄体色的形成与自身类胡萝卜素的含量密切相关，培育壳色艳丽 的文蛤新品系对文蛤养殖业具有重要的意义。在表观遗传学研究中，DNA 胞嘧啶甲基 化现象影响着生物体表型的改变，是真核生物基因组 DNA 修饰加工的方式之一。本研 究以 4 个文蛤品系（红壳、黑斑、白壳和细纹）为试验材料，显微观察其外套膜色素带 并采用分光光度计法对红壳和白壳文蛤外套膜中的类胡萝卜素含量进行测定；从文蛤转 录组文库中筛选出类胡萝卜素积累过程的两个关键酶——GGPP 合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase ， GGPS ）、 β- 胡 萝 卜 素 加 氧 酶 （ beta,beta-carotene 9,10-oxygenase-like，crtO）的 EST 序列，利用 RACE 技术获得了 GGPS 和 crtO 基因的 cDNA 全长，并利用 qRT-PCR 技术对 GGPS 和 crtO 基因在不同壳色文蛤（红壳、粉红 壳、黑斑和白壳）外套膜、红壳文蛤不同发育时期和不同组织中的表达量进行分析，试 图探究类胡萝卜素在不同壳色文蛤外套膜中的沉积规律，为文蛤呈色机理的研究提供依 据；此外，利用 MSAP 标记技术分析 4 种壳色文蛤甲基化差异，探索 DNA 甲基化和文 蛤壳色之间的关系。主要研究结果如下： 1. 采用显微观察法观察红壳和白壳文蛤外套膜色素带，结果发现，黑斑个体的外 套膜边缘近贝壳面有一条较深的色素带，而且在同一贝壳上黑斑区域的色素带清晰，非 黑斑区域无色素带；红壳个体的外套膜边缘有一条红色的色素带，而白壳色个体没有色 素带。分光光度法测定和 SPASS 软件分析发现，红壳和白壳文蛤体内总类胡萝卜素含 量存在极显著差异，分别为 1.703ug/100g 和 0.50ug/100g。 2. 获得了文蛤 GGPP 合成酶基因的 cDNA 全长序列，该 cDNA 全长 1130bp，开 放阅读框 882bp，编码 293 个氨基酸，推算分子量约为 33.7kDr，理论等电点为 6.64； 氨基酸序列比对表明，其与非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）和 海蜗牛（Aplysia californica） 的序列有较高同源性，分别达到 74.1%和 73.7%；对其结构预测显示，该蛋白具有异戊 I 二烯转移酶中 2 个保守的特征结构域（LLIDDIEDNSNLRRG 和 LGLYFQIRDDYAN）。 crtO 基因的 cDNA 全长为 2967bp，开放阅读框 1827bp，编码 608 个氨基酸，推测分子 量 68.09kDa，理论等电点为 5.58；该基因所编码蛋白质的氨基酸序列与鸡（Gallus gallus） 和绿海龟（Chrysemys picta bellii）的相似性分别为 50.1% 和 45.5%。 3. 利用 qRT-PCR 技术对 GGPS 和 crtO 基因在文蛤红壳、粉红壳、黑斑和白壳群 体外套膜中的表达量进行了分析，结果发现 GGPS 和 crtO 基因在红壳文蛤中的表达量 均最高，粉红壳和黑斑次之，白壳最低，由此初步推测文蛤壳色的形成与体内类胡萝卜 素相关。 GGPS 基因和 crtO 基因在红壳文蛤不同发育时期（卵子、细胞、囊胚、原肠胚、单 轮期、眼点和稚贝）的表达量进行统计，GGPS 基因和 crtO 基因在各发育时期均有表达， 其中在眼点期的表达量极高，明显区别于其他发育阶段，另外，两基因在各发育时期的 表达量总体上呈现不统一的上调与下调交互的趋势。GGPS 在原肠胚和囊胚期的表达量 基本相近，crtO 基因在囊胚和单轮期的表达量基本相近。到稚贝期，两基因的表达量都 较眼点略低，但 GGPS 的下降幅度远大于 crtO 基因。GGPS 基因和 crtO 基因在红壳文 蛤不同组织（鳃、外套膜、闭壳肌、足、内脏团和水管）的表达量进行统计，GGPS 基 因和 crtO 基因在外套膜中的表达量显著高于其它组织，并且 GGPS 基因在外套膜中的 表达量又高于 crtO 基因。 4. 利用 MSAP 分析技术对红壳、黑斑、细纹和白壳 4 种壳色文蛤的甲基化水平及 壳色差