鼠伤寒沙门菌spvb、spvc基因缺陷变异株的构建及其生物学特性研究-construction and biological characteristics of salmonella typhimurium spvb and spvc gene defective mutant.docxVIP

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 目的： 构建鼠伤寒沙门菌 spvB、spvC 基因缺陷变异株，并对其生物学特性进行比 较研究。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因 spvB、spvC 致病机制提供理论和实 验依据，并为后续细胞实验及利用小鼠模型进一步研究该基因的功能提供工具 和手段。 方法： 1、用自杀质粒介导的同源重组方法，制备鼠伤寒沙门菌 spvB/spvC 基因缺 陷变异株。根据 GeneBank 数据库中鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因 spvB/spvC 序列， 用 Primer Premier 5.0 软件设计 PCR 特异性引物，并在各个引物 5’末端加上适当 的酶切位点，分别扩增获得 spvB/spvC 基因缺陷性核苷酸片段后，连接至自杀质 粒 pCVD442。将重组的阳性自杀质粒转化入感受态细菌 SM10 λpir 内，并以接 合转移的方法导入含有 spvB/spvC 基因的鼠伤寒沙门菌野生株中，用蔗糖诱导同 源重组。以 PCR 扩增方法观察重组现象，将完全重组的菌株作为 spvB/spvC 基 因的缺陷变异株，挑选稳定传代的突变株并进行基因测序鉴定。 2、鼠伤寒沙门菌 spvB、spvC 基因缺陷变异株及野生株的生物学特性比较 研究。对两个缺失菌株的遗传稳定性、生长特性及酸性条件下的生存能力进行 比较研究。分别将菌株在 LB 液体培养基中 37℃培养 12h，每隔 1h 取样平板计 数。将菌株分别在 LB 琼脂平板中连续传代 50 代，每隔 5 代挑取单菌落，PCR 扩增鉴定，以研究缺失的基因在鼠伤寒沙门菌基因缺陷变异株中的遗传稳定性。 用 2mL PH4.0 的新鲜 LB 培养基分别培养基因缺失菌株及野生型鼠伤寒沙门菌 2h，从第 0h 起每隔 1h 取菌液适当稀释后采用平板活菌计数法测定活菌数，计 算生存率。 结果： 1、成功构建鼠伤寒沙门菌 spvB、spvC 基因缺陷株，经 PCR 及序列分析证 实，spvB 变异株中 spvB 基因的编码区有 1749 个碱基缺失，spvC 基因变异株中 spvC 基因的编码区有 711 个碱基缺失，且没有发生极性突变。 2、基因缺陷变异株与野生型相比，无酸条件下的生长特性没有明显差别。 II 酸性条件下，spvB、spvC 基因缺陷株和野生株的活菌数都比非酸性条件下的活 菌数明显降低；且三组菌株在培养第 2h 时后的生存率均低于第 1h 后的生存率， 差异有明显统计学意义（P0.01）。spvB、spvC 基因缺陷株在酸性环境中培养 1h、 2h 后接种到 LB 平板生长的菌落数（活菌数）比野生株明显减少（P0.01），且 生存率均低于野生株（P0.05），差异有统计学意义。两种单基因缺陷株相比在 第 1h 的活菌数及生存率的差异无统计学意义（P0.05）；在第 2h 的 spvB 基因缺 陷株的活菌数低于 spvC 基因缺陷株的活菌数，差异有统计学意义（P0.05），但 生存率的差异无统计学意义（P0.05）。 结论： 1、运用自杀质粒成功构建了鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因 spvB/spvC 基因缺 陷变异株；为进一步研究该质粒基因的功能提供了工具和手段。 2、基因缺陷变异株与野生型相比，在无酸条件下的生长特性没有明显差别； 酸性环境对沙门菌的生长有一定的选择性，且在接触酸性环境的 2h 内随着时间 的延长选择性逐渐增强；沙门菌质粒毒力基因 spvB、spvC 在鼠伤寒沙门菌克服 酸应激时可能发挥重要作用，但两基因之间比较对耐酸的影响无明显差异。 关键词：鼠伤寒沙门菌；spvB；spvC；基因缺陷变异；同源重组；生长曲线 III Ab Abstract ABSTRACT Objective： To investigate the influence of the Salmonella plasmid virulence gene B/C (spvB/spvC) on biological characteristics, we construct spvB/spvC defect strains. Therefore provide theoretical and experimental basis for discussing the pathogenic mechanism of the spvB/spvC, and provide tools and means for further study on the function of the gene using cell and mouse infection model. Methods： The spvB/spvC deleted